材料和试剂

Vigna mungo MYMIV抗性重组近交系，VMR84
mirPremier微小RNA分离试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：SNC10）
Mir-X miRNA FirstStrand合成和SYBR qRT-PCR试剂盒（Takara Bio Company，Clontech，目录号：638314）
2-巯基乙醇（Sisco Research Laboratories，目录号：1324196）
乙醇（Merck，目录号：K41540783）
液氮和干冰
无RNA酶水（Bangalore Genei，目录号：612151181001730）
琼脂糖（Sisco Research Laboratories，目录号：0140229）
溴化乙锭（Sisco Research Laboratories，目录号：054817）
1x TAE缓冲区（请参阅配方）
溴化乙锭原料（见配方）

设备

热循环仪（DNA Engine Cycler，型号：PTC-200）
实时qPCR（Biorad iQ5实时PCR检测系统）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：MicroCL21）
电泳装置（Bangalore Genei）
热块或水浴
砂浆和杵
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）

程序

植物材料和生长条件
< em> Vigna mungo 重组近交系VMR84用于分离小RNA。
1. 将成熟的种子用0.1％HgCl 2表面灭菌10分钟，并在去离子水中漂洗两次。
2. 表面灭菌的种子在潮湿的滤纸中发芽在28±1℃和70％相对湿度，16小时光照和8小时黑暗
3. 然后发芽的种子（孵育三天后）转移到无菌土壤混合物中并在温室中在25±1下生长 C。在21天的幼苗生长后（在16小时光照和8小时黑暗），幼小收集三叶叶，在液氮中冷冻并储存在-80℃直至RNA分离。
小RNA分离
1. 使用mirPremier从V豆mungo组织中分离小RNA 微RNA分离试剂盒按照制造商的说明书进行一些修改。
2. 使用研钵和杵将收获的叶组织在液氮中研磨成细粉。
3. 将750μl裂解缓冲液加入到冷冻的组织粉末中（80 mg），涡旋2分钟并在55℃下温育5分钟
4. 然后将样品以最大速度离心5分钟以除去细胞碎片，基因组DNA和大RNA。
5. 将溶胞产物上清液（800μl大约）过滤通过过滤柱，将流出液与100％乙醇混合立即混合。
6. 然后使裂解物通过结合柱，并以最大速度离心30秒，流出液体倾析。
7. 结合后，柱子首先用700μl100％乙醇洗涤，并以14,000×g离心30秒，然后弃去流出物。
8. 第二通过向柱中加入500μl结合溶液进行洗涤以最大速度（14,000×g ）离心1分钟
9. 后来将500ml乙醇稀释的洗涤溶液2加入到柱中用于第三次洗涤。在以最大速度（14,000×g/g）离心后 30秒，弃去流出液。
10. 进行用乙醇稀释的洗涤溶液2（500ml）的第二次洗涤，并弃去流出液。
11. 接下来，通过以最大速度（14,000x）离心来干燥柱 g ）1分钟。小心地从柱中取出柱管组件离心以避免残留的流通液体飞溅干燥柱。
12. 使用50ml从柱上洗脱小RNA 洗脱溶液并通过在16,000×g离心和该过程以提高小RNA产率。纯化的RNA储存于37℃ -20℃。
13. 进行了RNA的定量和定性分析通过NanoDrop用1μl样品，随后是琼脂糖凝胶电泳分离。在260至280nm的吸光度比，通过（A sub-A sub-320）/（A sub-280-Sub 320）计算出的值通常在1.8 和 2.2。
第一链cDNA合成
将小RNA多聚腺苷酸化并使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis试剂盒根据制造商的说明书逆转录。
1. 简言之，将5μlmRQ缓冲液（2x），5μgRNA和1.25μlmRQ酶混合在10μl的反应体积中，并在热循环仪中温育1小时在37℃下，然后在85℃终止5分钟以使酶失活。
2. 逆转录后，通过加入90μl稀释cDNA 核酸酶游离水使总体积达到100μl。反之转录的cDNA现在准备用于miRNA定量。
qPCR对miRNA的定量
使用Mir-X miRNA qPCR SYBR试剂盒进行定量实时PCR。方法如下：
1. qPCR引物设计：建议使用整个引物所需或相关植物物种的成熟miRNA的序列（可获得在mirBase中）作为miRNA特异性，5'引物。 qPCR的3'引物是 mRQ 3'引物
2. 通过qPCR扩增miRNA
  1. 使用Δ-δCt方法来量化每个的存在 miRNA相对于U6 snRNA的水平，内部对照。为了这实验，对每个cDNA进行U6 snRNA的qPCR扩增样品重复。此外，包括适当的进行每个引物组的模板对照（NTC）以证实不存在基因组DNA污染。
  2. 对于每个qPCR反应， μlPCR反应混合物，包含1x SYBR优点预混物，1×ROX染料，0.2mM的正向和反向引物和50ng 的第一链cDNA。对于U6反应，正向和反向使用试剂盒提供的U6引物
  3. qPCR反应在96孔板中在95℃孵育2分钟，然后是40℃ 95℃10秒和60℃20秒的循环。扩增循环随后进行56至95℃的熔解曲线分析 0.5℃，每10秒升温。每个的熔解曲线仔细观察扩增子以确认其特异性引物。记录阈值循环（Ct）值。
3. 使用Delta-Delta Ct（或ddCt）方法进行数据分析和计算miRNA水平 ddCt方法提供了miRNA的相对水平的测量通过将它们与归一化标准比较来确定。这里对每个样品扩增miRNA和U6RNA以确定 Ct值。这允许使用ddCt确定相对水平计算。
  相对拷贝数使用ddCt方法计算：
  [miR-X] /[miR-X] ：2 ）
  然而，这种量化方法的精度取决于引物对的扩增效率应该接近100％否则量化将不准确。
  
  图1.熔体曲线分析在qPCR分析期间产生的mir156。图表显示了一个图表的荧光对温度（°C）的负导数 miRNA扩增。单峰的存在表示非特异性扩增单一产物。

食谱

1x TAE（1 L）
加入242g Tris碱（MW 121.1），57.1ml冰醋酸100ml 0.5M EDTA，并在600ml ddH 2 O中混合，并将最终体积调节至1L。< br/> 然后将20ml50×TAE加入到980ml ddH 2 O中以制备1L 1x TAE（在25℃下pH 8.3）。
溴化乙锭产品
将1g溴化乙锭溶解在100ml ddH 2 O中以制备10mg/ml的储备液。

致谢

该协议的原始版本在Paul等人中描述。（2014年）。这项工作得到印度新德里科学和工业研究理事会荣誉名誉科学家项目[第21（0884）/12/EMR-II号]的支持。

参考文献

Paul，S.，Kundu，A。和Pal，A。（2014）。来自叶小RNA的<ν> Vigna mungo 微RNA的鉴定和表达谱通过深度测序进行转录组。 J Integr Plant Biol 56（1）：15-23。