材料和试剂

PBMC（新鲜或解冻冷冻）
RPMI-1640（Hyclone，目录号：SH30027.01）
FBS（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
100x Pen-strep-Glutamine（Hyclone，目录号：SV30082.01）
Benzonase（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
PBS（10x储备液）（Rockland，目录号：MB-008）
叠氮化钠（10％w/v溶液）（Teknova，目录号：S0209）
PMA（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
离子霉素（Calbiochem ，目录号：407952）
Dynabeads人T激活剂CD3/CD28（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：111.32D）
布雷菲德菌素A（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
1,000x莫能菌素（BioLegend，目录号：420701）
0.5M EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E-5134）
LIVE/DEAD 可固定红色死细胞染色剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：L23102）
10x FACS裂解液（BD Biosciences，目录号：349202）
10x FACS透化溶液2（BD Biosciences，目录号：347692）
荧光染料连接的表面标记[例如CD3-V500（BD Biosciences，目录号：561416）; CD8-V450（BD Biosciences，目录号：560348）; CD4-PerCP-Cy5.5（BD Biosciences，目录号：341654）]
荧光染料连接的细胞因子抗体[例如IFNγ-FITC（BD Biosciences，目录号：340449）; IL-17PE（BD Biosciences，目录号：560438）; IL-2 PE-Cy7（BD Biosciences，目录号：560707）; IL- 22-APC（R& D systems，目录号：IC7821A）; TNF-Alexa fluor 700（BD Biosciences，目录号：557996）]
BD CompBeads [（抗小鼠Igκ，抗大鼠Igκ或抗大鼠/仓鼠Igκ; BD Biosciences）用于产生单色补偿对照（BD Biosciences，目录号：560707）]
用于单色补偿的免疫球蛋白捕获珠子（例如，BD Biosciences，目录号：560497）
完成RPMI（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

96-深孔V底板（Corning，目录号：3960）（在2ml孔体积中洗涤1ml）
Falcon圆底FACS管
用于Dynabead分离的磁铁（BD Biosciences，IMag，目录号：552311）
37°C水浴
生物安全柜
离心机
CO 2培养箱中37℃培养
校准移液器
ViCell（Beckman Coulter）或血细胞计数器计数器

程序

解冻PBMC
1. 温热完全培养基至37℃水浴。每个样品将需要22 ml具有benzonase的培养基。计算解冻所需的金额样品，并用1：10,000制备单独的温热培养基等分试样 benzonase（终浓度：25U/ml）。解冻不超过3个样品一个时间。
  注意：如果进行大量纵向研究分成两批，则对每批样品运行一个控制PBMC。
2. 从液氮中取出样品，并在干冰上运输到实验室
3. 将10毫升温热的benzonase培养基放入15毫升管，为每个样品制作一个单独的管。
4. 在37℃水浴中解冻冷冻的小瓶。
5. 当细胞几乎完全解冻，携带到罩。
6. 加入1毫升温暖的benzonase培养基从适当标记离心管慢慢地将细胞转移到细胞中离心管。用更多的介质从离心管冲洗小瓶检索所有单元格。
7. 尽快继续其余样品。
8. 以1550rpm（RCF = 473）离心细胞，在室温下离心10分钟
9. 倾析或吸出细胞的上清液，并通过轻敲管子重悬沉淀
10. 轻轻地将沉淀重悬在1ml温热的benzonase培养基中。过滤细胞通过70微米的细胞过滤器。加9ml以上温热 benzonase培养基到管中
11. 以1550rpm离心细胞（RCF = 473），在室温下10分钟。倾析或吸出上清液从细胞和通过轻拍管重悬颗粒
12. 将细胞重悬于1ml温热培养基中
13. 计数细胞与Vicell（或如果必要的血细胞计数器）。计数，取20微升细胞，并用480微升PBS在vicell计数室中稀释。作为PBMC以1:25稀释倍数加载到Vicell上
14. 用温热培养基（此时不再有benzonase）将细胞浓度调节至5-10×10 6个细胞/ml。
15. 使用多通道移液器，加入200微升细胞（1×10 6个细胞）每孔96孔深孔板。将每个样品分成两个或更多的井保持一个作为未刺激的控制和其他不同类型的刺激
16. 在37℃下在CO 2培养箱中休息过夜（6-18小时）注意：CD4 ⁺ 和CD8 ^{/sup> 细胞因子产生性T细胞在刺激后过夜休息后增加（Horton et al。，2007）。}

刺激细胞

在37℃下过夜休息后，加入活化试剂和分泌物抑制剂（布雷菲德菌素A /莫能菌素）加入到孔中用于刺激。仅添加分泌抑制剂到未刺激的对照孔。

表1.蛋白质分泌抑制剂

试剂	库存集中	中级稀释	最终集中
布雷菲德菌素A	在DMSO中5mg/ml（以等分试样在-20℃下储存）	1:10在PBS	10μg/ml（1:50）或 5μg/ml（1:100）和莫能菌素
莫能菌	5mg/ml的乙醇溶液（4℃保存）	1:10在PBS	10μg/ml（1:50）或 5μg/ml（1:100）和布雷菲德菌素A/B

表2.激活器

试剂	库存集中	中级稀释	最终集中
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13（PMA）	1mg/ml的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1：1,000在PBS中	10 ng/ml
离子霉素	1mg/ml的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1:10在PBS	1μg/ml
植物凝集素（PHA）	1mg/ml的DMSO溶液（储存在4℃）	1:10在PBS	1μg/ml
SEB	50μg/ml，在PBS中	无	1μg/ml
肽混合物	0.5-1mg/ml/pep于DMSO中（以等分试样储存于-20℃）	1:10在PBS	1μg/ml /肽
抗CD3/CD28	按照制造商说明	-	-

注意：

避免溶剂毒性是重要的。最终DMSO +乙醇浓度从所有来源（肽，布雷菲德菌素A，莫能菌素）应该不超过0.5％。
对大多数细胞因子：使用10μg/ml的布雷菲德菌素A. 最终浓度（见储备制备表）。对于CD107和CD154：使用最终浓度为10μg/ml的莫能菌素（见制备物表）。对于组合细胞因子和CD107或CD154的测定：使用布雷菲德菌素 A和莫能菌素，每种终浓度为5μg/ml。
可以将荧光染料标记的CD107和CD154加入培养物中在浓度为2μg/ml的刺激期间。这允许染色在细胞期间再内化的靶分子激活过程。
添加共刺激抗体是可选的。这些可以增加细胞因子对蛋白质抗原的反应，肽和SEB，通过扩增低亲和力T细胞的信号（Waldrop等人，1998）。加入1μg/ml终浓度的CD28和/或如果标记的分析是，可以使用CD49d（标记的抗体需要）。

孵育细胞4小时（PMA +离子霉素刺激，PHA +离子霉素刺激）或6-8小时（SEB，抗CD3/CD28 刺激，肽刺激）在37℃下在CO 2培养箱中培养。
注意：对于大多数细胞因子，在37℃下孵育6-12小时是足够的; 对于IL-10和TGF的最佳培养时间为12-24小时。
加入EDTA至终浓度为2mM，并在室温下孵育15分钟注意：如果Dynabeads已被用于刺激，请在此步骤中使用I Mag去除珠粒。
用PBS以1,550rpm（RCF = 473）洗涤细胞，在室温下洗8分钟。

染色

重复PBS洗涤在1,550 rpm（RCF = 473），8分钟，室温和重悬细胞在500μlPBS。
根据制造商的说明用红色LIVE/DEAD细胞活力染料染色。
在室温下避光孵育30分钟。
以1550rpm（RCF = 473℃）离心细胞，10分钟，室温
轻轻或吸出以除去上清液，并用PBS以1,550rpm（RCF = 473），10分钟，室温洗涤细胞。
在FACS缓冲液中以1550rpm（RCF = 473）重复另一次洗涤，10分钟，室温。
轻轻或吸出以除去上清液，并在剩余体积中重悬细胞
根据每个测试的滴度制备表面染色混合物（预定/由制造商提供）。参见下面的例子是染色十个管/孔注意：制造商的推荐剂量是一个很好的起点，但抗体滴定开代表性细胞可以提高对不良染色的结果。

表3.表面染色鸡尾酒

抗体面板
污渍
滴定（μl/样品）
X个样品
总μl

CD3
V 500
5
10
50

CD4
perCPCy 5.5
10
10
200

CD8
V 450
5
10
50

注意：如果进行同时四聚体分析，在单独的步骤中用抗 - 共同受体抗体染色之前，细胞应用pMHC多聚体染色，洗涤，然后用表面染色混合物染色。
/>
将每个样品的计算体积的染色混合物加入（20μl 在上面的例子中）。加入适量的单一抗体珠补偿控制。
在室温下在黑暗中孵育细胞30分钟
向每个孔/管中加入2ml FACS缓冲液
以1550rpm（RCF = 473℃）离心细胞，10分钟，室温
轻拂或吸出以除去上清液并再次用细胞洗涤细胞 FACS缓冲液以1550rpm（RCF = 473℃），10分钟，室温
准备1x BD FACS裂解溶液（在水中10x稀释至1x）。
每管加入2毫升/孔，混匀，并在室温下，在黑暗中孵育细胞10分钟。
在4℃下以2,000rpm（RCF = 787）离心细胞10分钟，轻弹或吸出以除去上清液。
在FACS缓冲液中洗涤细胞两次
准备1x BD FACS Perm-2缓冲液（10x在水中稀释至1x）
将细胞沉淀重悬在500μl1×FACS透化溶液（上面制备）中，并在暗处孵育15分钟。
离心细胞在2000 rpm（RCF = 787）10分钟，轻弹或吸出去除上清。
在FACS缓冲液中洗涤细胞两次
轻轻或吸出以除去上清液，并在剩余体积中重悬细胞

根据滴度制备细胞内染色混合物测试每种抗体（预定/由制造商提供）。看到下面的例子用于染色10个管/孔。

表4.细胞内染色混合物

抗体面板	污渍	滴定（μl/样品）	X个样品	总μl
IFN-γ	FITC	20	10	200
IL-17	PE	20	10	200
IL-4	APC	5	10	50
TNFα	Alexa700	1.2	10	12
IL-2	PE-Cy7	5	10	50

计算并向每个添加所需体积的染色混合物样品（在上述实施例中为51.2μl）并将细胞孵育30分钟，黑暗。
向每个孔/管中加入2ml FACS缓冲液
离心细胞在2,000 rpm离心10分钟，轻弹或吸出去除上清
在FACS缓冲液中洗涤细胞两次
轻轻或吸出以除去上清液，并在最终体积为150μl用于Flow的FACS缓冲液中重悬。

代表数据

图1.T细胞（IFNg，TNF，IL-2，IL-17，IL-22）的细胞内细胞因子产生。每行中的前三个图显示CD4 和CD8 ⁺ T细胞。接下来的三个图的下一组显示了CD4 + T细胞的细胞因子产生，最后一组显示了CD8 + T细胞的细胞因子产生。（A）未刺激（B）PMA和离子霉素刺激（C）PHA和离子霉素刺激（D）抗CD3/CD28刺激。

笔记

在染色，固定和透化细胞后进行足够数量的洗涤对于降低细胞因子的背景水平是非常重要的。
如果在96孔板中进行实验，在未刺激和刺激条件之间留出几个孔，以尽量减少洗涤时溢出和交叉污染的机会。

食谱

完成RPMI
RPMI
10％血清（例如FBS）
Pen-strep
谷氨酰胺
FACS缓冲区
具有2％血清（例如FBS）和0.1％叠氮化钠的PBS

参考文献

Horton，H.，Thomas，E.P.，Stucky，J.A.，Frank，I.，Moodie，Z.，Huang，Y.，Chiu，Y.L.，McElrath，M.J.and De Rosa，优化和验证8色细胞内细胞因子染色（ICS）测定以定量抗原特异性T由免疫接种诱导的细胞。 Immunol Methods 323（1）：39-54。
Jung，T.，Schauer，U.，Heusser，C.，Neumann，C.and Rieger，C。（1993）。通过流式细胞术检测细胞内细胞因子。 J Immunol方法 159（1-2）：197-207。
Lovelace，P.，和Maecker，H.T。（2010）。参见：Hawley，T.S。和Hawley，R.G。（eds）。多参数细胞内细胞因子染色。 Humana Press，165-178
Nylander，S。和Kalies，I。（1999）。 Brefeldin A，但不是莫能菌素，完全阻断CD69在小鼠淋巴细胞上的表达：蛋白质分泌抑制剂的功效在通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色的方案中。< j> J Immunol Methods 224（1-2）：69-76。
Pitcher，C.J.，Quittner，C.，Peterson，D.M.，Connors，M.，Koup，R.A.，Maino，V.C.and Picker，L.J。（1999）。 HIV-1特异性CD4 ⁺ T细胞在具有活性HIV-1感染的大多数个体中是可检测的，但随着病毒抑制的延长而下降。 Nat Med 5（5）：518-525。
Waldrop，S.L.，Davis，K.A.，Maino，V.C。和Picker，L.J。（1998）。正常人CD4 ⁺记忆T细胞在其活化阈值中显示出广泛的异质性用于细胞因子合成。 Immunol 161（10）：5284-5295。