材料和试剂

用于检测蛋白质 - 蛋白质相互作用的抗体对（两种一抗必须在不同物种中产生，例如来自Cell Signaling Technology的兔抗EGFR，目录号：2232;小鼠抗DNA-PK 来自BD Pharmingen，目录号：556456）
Duolink ^TM 原位试剂
1. Duolink ^TM 原位 PLA试剂
  1. Duolink原位互补寡核苷酸探针MINUS和PLUS [5x，二抗偶联与PLA寡核苷酸，PLA探针的选择取决于您的主要抗体种类：例如抗兔PLUS （Sigma-Aldrich，目录号：DUO82029）; 抗鼠MINUS （Sigma-Aldrich，目录号：DUO 92004）]
  2. 封闭溶液（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82014）：用于阻断样品if 你还没有用另一个优化你的一级抗体封闭溶液，例如PBS中的2％BSA。
  3. 抗体稀释液（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82015）：用于稀释PLA探针和第一抗体，或者具有1％BSA的PBS溶液以及。
2. Duolink检测试剂
  1. 连接试剂（5x，包含与PLA探针杂交的寡核苷酸和所有除了连接酶之外的连接所需的组分）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82016）
  2. 连接酶（1单位/μl）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82029）
  3. 扩增试剂（5x，包含所需的所有组分除聚合酶外的滚环扩增。包括也用与之杂交的荧光团标记的寡核苷酸探针 RCA产品）：含有远红色荧光标记寡核苷酸（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82019）
  4. 聚合酶（10单位/μl）:( Sigma-Aldrich，目录号：DUO82030）
    Duolink检测试剂可作为试剂盒购买 Sigma-Aldrich（例如 Duolink 原位检测的目录号试剂远红DUO92013）。
3. Duolink洗涤缓冲液A和B（见配方）
用DAPI（Life Technologies，目录号：P-36931）的ProLong Gold抗衰减试剂，或者可以单独使用常规免疫荧光封固剂和DAPI。
试剂固定和透化所需的试剂（例如3.7％新鲜制备的甲醛和稀释在PBS中的0.1％Triton X-100）

Duolink检测试剂可作为试剂盒购买 Sigma-Aldrich（例如 Duolink 原位检测的目录号试剂远红DUO92013）。

Duolink洗涤缓冲液A和B（见配方）

用DAPI（Life Technologies，目录号：P-36931）的ProLong Gold抗衰减试剂，或者可以单独使用常规免疫荧光封固剂和DAPI。

试剂固定和透化所需的试剂（例如3.7％新鲜制备的甲醛和稀释在PBS中的0.1％Triton X-100）

... Duolink检测试剂可作为试剂盒购买 Sigma-Aldrich（例如 Duolink 原位检测的目录号试剂远红DUO92013）。

Duolink洗涤缓冲液A和B（见配方）

用DAPI（Life Technologies，目录号：P-36931）的ProLong Gold抗衰减试剂，或者可以单独使用常规免疫荧光封固剂和DAPI。

试剂固定和透化所需的试剂（例如3.7％新鲜制备的甲醛和稀释在PBS中的0.1％Triton X-100）

...... Duolink检测试剂可作为试剂盒购买 Sigma-Aldrich（例如 Duolink 原位检测的目录号试剂远红DUO92013）。

Duolink洗涤缓冲液A和B（见配方）

用DAPI（Life Technologies，目录号：P-36931）的ProLong Gold抗衰减试剂，或者可以单独使用常规免疫荧光封固剂和DAPI。

试剂固定和透化所需的试剂（例如3.7％新鲜制备的甲醛和稀释在PBS中的0.1％Triton X-100）

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用PBS洗涤细胞，用3.7％甲醛固定15分钟，用0.1％Triton X-100透化10分钟，洗涤，然后用Duolink封闭缓冲液封闭1小时（所有这些步骤通常在室温下进行;如果您已经优化了您的测定，使用相同的条件Duolink）。

将盖玻片转移到加湿室中（图1），然后将小体积靶向研究中的蛋白质的一级抗体移液到每个盖玻片上（对于12mm盖玻片，加入抗体稀释液中的20-40μl抗体大于足够）。抗原 - 抗体相互作用将主要在室温下在1小时内完成，或在4℃下在轻微搅拌下过夜（残余溶液可以使用组织吸收以在每个载玻片上获得相等的残余体积，因为这将影响重现性。然而，在添加一抗之前不允许样品干燥，因为这将导致背景）。

将两种相应的PLA探针混合并在抗体稀释液中稀释（1:5）。使混合物在室温下静置20分钟（例如，对于50μl反应，取10μlPLA探针MINUS原液，10μlPLA探针PLUS原液和30μl抗体稀释液）。样品用PBS + 0.05％Tween洗涤两次，然后与PLA探针MINUS和PLUS在37℃孵育1小时。

在温和搅拌下，将样品在1×洗涤缓冲液A中洗涤2×5分钟，并且通过连接 - 连接酶溶液将探针与另外两个形成环的DNA寡核苷酸在37℃下连接30分钟（1:40稀释，包括的两个寡核苷酸和连接酶以将寡核苷酸杂交到两个PLA探针，并且如果它们非常接近则连接到闭合圆）。

将样品在1×洗涤缓冲液A中在轻轻搅拌下洗涤2×2分钟，通过酶连接的两个添加的寡核苷酸通过滚环扩增通过与扩增 - 聚合酶溶液（1:80稀释）在37℃下90分钟（由核苷酸和荧光标记的寡核苷酸组成，其与聚合酶一起加入）。荧光标记的寡核苷酸将与连接的圆作为模板，并且信号作为荧光显微镜的不同荧光点容易可见）。

样品在1x洗涤缓冲液B中洗涤2×10分钟，然后通过在高纯度水中稀释1×缓冲液B 1：100洗涤0.01x洗涤缓冲液B 1分钟。
注意：在上述步骤6-8中，洗涤缓冲液A和B的体积取决于盖玻片的大小，对于小的（12mm），我们通常在12孔板中使用1ml洗涤缓冲液。

将样品在室温下在黑暗中在通风橱中干燥约10分钟，并且在具有DAPI的最小体积的ProLong Gold抗衰退试剂中安装到载玻片上。

荧光信号扩增用于测定，并且使用荧光或共焦显微镜，使用至少20x物镜检测相互作用。成像后，载玻片可在-20℃下避光保存

图1.孵育室。用一块石蜡膜覆盖6孔板以用细胞支撑盖玻片，并使用另一个盖子来防止样品干燥。室被设计为在组织培养箱中在37℃下孵育大部分PLA反应。

代表数据

图2.乳腺癌细胞系MDA-MB-468中表皮生长因子受体（EGFR）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）之间的蛋白质相互作用的Duolink邻近连接测定。在不同时间点用DNA损伤剂依托泊苷（20μM）处理，然后如所述进行EGFR和IGFBP-3之间的Duolink测定（作为阴性对照的细胞）。每个红色斑点代表单一相互作用，DNA用DAPI染色。

食谱

Duolink 原位清洗缓冲液A
8.8克NaCl 1.2克Tris碱
0.5ml吐温20 用HCl
调节pH至7.4 将高纯度dH 2 O加至1,000ml（终浓度0.01M Tris，0.15M NaCl和0.05％Tween 20）中
过滤灭菌（0.22μm）
储存于4°C，使用前将溶液置于室温下
Duolink 原位洗涤缓冲液B
5.84g NaCl
4.24g Tris碱
26.0g Tris-HCl
使用HCl
调节pH至7.5 将高纯度dH 2 O加至1,000ml（终浓度0.2M Tris和0.1M NaCl）中
通过0.22μm过滤器过滤溶液
储存于4°C。使用前将溶液置于室温下

致谢

这项工作是由澳大利亚研究委员会的RCB拨款号DP0984232支持的。

参考文献

Soderberg，O.，Gullberg，M.，Jarvius，M.，Ridderstrale，K.，Leuchowius，KJ，Jarvius，J.，Wester，K.，Hydbring，P.，Bahram，F.，Larsson，LGand Landegren， U.（2006）。通过邻近连接直接观察单个内源性蛋白复合物 /a> Nat Methods 3（12）：995-1000。