材料和试剂

HEK293T细胞系（ATCC 号：CRL-11268）
Dulbecco's Modified Eagle's medium F12（DMEM-F12）（Biowest，目录号：L0090）
10％（v/v）胎牛血清（Lonza，目录号：DE14-801F）
200mM L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：17-605E）
青霉素和链霉素（Lonza，目录号：17-603E）
液氮
1x DPBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-094）
1x Percoll（见配方）
缓冲区A（参见配方）
2x CHAPS（请参阅配方）
1x CHAPS（请参阅配方）

设备

具有快速释放螺帽75通气的组织培养瓶（SARSTEDT AG，目录号：83.1813.002）
具有盖子，疏水性，无菌（SARSTEDT AG，目录号：83.1839）的组织培养板
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
用于15ml Falcon管（Sigma-Aldrich，目录号：3K30）的带有转子的台式冷却离心机
带有用于2ml管（HERMLE，目录号：Z216MK）的转子的台式冷却微量离心机
37℃水浴
注射器（1ml）（Nipro注射器，目录号：SY31SCTU EC）
20 G和25 G针（Becton，Dickinson and Company，目录号：300600）
组织培养II级层流罩（Telstar Bio II）
带落射荧光的倒置显微镜（Nikon Eclipse Ti）
伯克计数室
Ultrafree-CL低结合Durapore PVDF膜（5μm）（EMD Millipore，目录号：UFC40S25）

程序

除非另有说明，否则在冰上进行所有步骤，并在4°C下进行所有离心开始从保持在补充有10％FCS，2mM Glutamax的DMEM：F12（1:1）中的瞬时表达ASC-YFP或稳定表达NLRP3（p.D303N）-YFP的10 7 HEK293的纯化， 1％青霉素 - 链霉素。

用温热的PBS洗涤细胞，并用6ml冷PBS通过上下吹吸瓶底部分离它们。将细胞悬浮液转移到15ml管中（从1到8的步骤的代表性方案显示在图1中）。
通过在2,000xg下离心3分钟使细胞沉淀。弃去上清液并将沉淀重悬在600μl冷的Buffer-A中，并转移到1.5ml管中
缓冲液A中的细胞在冰上通过具有20G针的1ml注射器（10次），然后通过25G针（20次）裂解。之后，将裂解物在液氮（在液氮中保持约30-40秒，或直到裂解物冷冻）中冷冻，随后在37℃的水浴中解冻（重复该冻/融循环3次）。细胞裂解物再次通过25G针（10次）。
然后将裂解物在400×g离心8分钟。回收上清液，弃去沉淀。
将上清液转移到15ml管中，用2体积的CHAPS缓冲液2x稀释，然后使用5μm离心过滤器在2,000xg下过滤10分钟。弃去离心过滤器，保留滤液
将滤液用1体积的CHAPS缓冲液2x稀释并通过温和地上下吹打混合（该步骤是裂解细胞器，例如线粒体）。然后，将稀释的裂解物在2,300×g离心8分钟，回收沉淀，弃去上清液。
将沉淀重悬于1ml CHAPS缓冲液1x中，并以5000×g离心8分钟，弃去上清液并保留沉淀。重复此洗涤步骤两次。
在最后一次离心步骤后，将沉淀物重新悬浮于1ml CHAPS缓冲液1x中，并小心地装载在200μl40％Percoll（预先制备在1.5ml管中）的顶部。

图1. ASC和NLRP3（p.D303N）颗粒的纯化方案的代表性方案，说明从1到8的步骤
将Percoll在16,000×g离心10分钟（关闭断裂不是必需的）。通过吸移缓慢并轻轻地收集含有炎性体颗粒的界面层并转移到新的1.5ml管中，然后使用相同条件通过离心用1ml CHAPS缓冲液1x洗涤（图2）。
除去上清液，将沉淀重新悬浮于100μl1×CHAPS缓冲液中（图2）
最后，使用Bürker室使用1:10稀释液（该稀释度取决于回收的ASC或NLRP3颗粒的浓度）在荧光显微镜中定量荧光颗粒。定量后，调节体积直到达到每μl5×10 5个颗粒的密度。

图2. Percoll步骤（步骤8-10）的代表方案

代表数据

表1.在纯化方案后回收的荧光颗粒相对于表达ASC-YFP或NLRP3（p.D303N）-YFP的10 7个HEK293T细胞的预期量的实施例。在转染后48小时（表达ASC-YFP的细胞）或直到达到每个烧瓶（稳定表达NLRP3的细胞（pD303N）的90-100％汇合）分离细胞。所示数据来自在不同天进行的实验。

实验	Asc-YFP（10 ^{6 粒子）}	NLRP3（p.D303N）-YFP（10 ⁶粒子）
1	4.70	1.50
2	3.81	1.54
3	3.03	2.25
4	3.9	2.15
5	4.92	1.14
平均	4.07	1.72

图3.纯化方案后ASC和NLRP3（p.D303N）荧光颗粒的代表性图像

笔记

在步骤2中，可将细胞沉淀物在-80℃下冷冻（首先在液氮中然后在-80℃下）或用斑点纯化方案进行。
注意，离心后步骤4中回收的上清液不清楚

食谱

1x Percoll（制备200μl）
120μl1x CHAPS
80μlPercoll-Plus
缓冲区A
320mM蔗糖 20mM HEPES-KOH（pH7.5） 10 mM KCl
1.5mM MgCl 2·h/v 1mM EDTA
1 mM EGTA
2x CHAPS缓冲区
40mM HEPES-KOH（pH7.5） 10mM MgCl 2/
1 mM EGTA
0.2 mM PMSF
0.2％CHAPS
注意：1x CHAPS缓冲液通过用蒸馏水稀释CHAPS缓冲液2x来制备。

确认

该协议已经从先前发表的文章改编而来：Baroja-Mazo等人（2014）。这项工作得到了来自PN I + D + I 2008-2011-Salud Carlos III-FEDER研究所（PI13/00174）和欧洲研究理事会（ERC-2013-CoG 614578）的资助。作者声明没有利益冲突。

参考文献

Baroja-Mazo，A.，Martín-Sánchez，F.，Gomez，AI，Martínez，CM，Amores-Iniesta，J.，Compan，V.，Barberà-Cremades，M.，Yagüe，J.，Ruiz-Ortiz， E.和Antón，J。（2014）。 NLRP3炎症小体被释放为颗粒危险信号，放大炎症反应。 Nat Immunol 15：738-48
Fernandes-Alnemri，T。和Alnemri，E.S.（2008）。 ASC染色体的活性的装配，纯化和测定。 Methods Enzymol 442：251-270。
Franklin，BS，Bossaller，L.，De Nardo，D.，Ratter，JM，Stutz，A.，Engels，G.，Brenker，C.，Nordhoff，M.，Mirandola，SR和Al-Amoudi， 2014）。衔接子ASC具有增殖炎症的细胞外和"朊病毒"活性。 Nat Immunol 15（8）：727-737
Schroder，K。和Tschopp，J。（2010）。炎症小体。 140（6）：821 -832。