材料和试剂

PBMC（新鲜或解冻冷冻）
Benzonase（Pierce Antibodies，目录号：88701）
细胞因子等分试样（IFNα，IFNγ，IL-6，IL-7，IL-10，IL-21，IL-2等）
1. IFNa（PBL干扰素来源，目录号：11105-1）
2. IFNg2（BD Biosciences，目录号：554617）
3. IL6（BD Biosciences，目录号：550071）
4. IL7（BD Biosciences，目录号：554608）
5. IL10（BD Biosciences，目录号：554611）
6. IL21（Life Technologies，Gibco ，目录号：PHC0214）
7. IL2（BD Biosciences，目录号：554603）
8. CD3（BD Biosciences，目录号：555329）
9. CD28（BD Biosciences，目录号：555725）
10. LPS（Sigma-Aldrich，目录号：L7770）
11. IL5（Pepro Tech，目录号：200-05）
12. IL17A（Pepro Tech，目录号：200-17）
16％PFA（Alfa Aesar，目录号：4368）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：A452SK-1）
深井板（Costar，目录号：3960）
用0.1μm旋转过滤器（EMD Millipore，型号：UFC30VV00）过滤的表型和磷蛋白抗体
来自DVS的Ir-嵌入剂储备溶液（可以使用Rh103-嵌入剂）（目录号：201192B）
1×CyPBS PBS（Rockland，目录号：MB-008）
完成RPMI（参见配方）
CyFACS缓冲区（参见配方）

设备

37°C水浴
生物安全柜
离心机
CO 2培养箱中37℃培养
校准移液器
8或12针吸气器（V& P Scientific，型号：VP187A）

程序

解冻PBMC
1. 温热完成RPMI至37°C水浴。每个样品将需要20 ml的完全RPMI与benzonase以限制细胞聚集。计算解冻所有样品所需的量，并制备单独的等分试样温热培养基与1：10,000 benzonase（终浓度25U/ml）。去掉来自液氮的样品并在干冰上运输到实验室
2. 将10毫升温热的benzonase培养基放入15毫升管，为每个样品制作一个单独的管。
3. 在37℃水浴中解冻冷冻的小瓶。
4. 当细胞被部分解冻，携带到罩。
5. 从适当标记加入1毫升温暖benzonase培养基离心管慢慢地将细胞转移到细胞中离心管。用更多的培养基从离心管中冲洗小瓶检索所有单元格。
6. 尽快继续其余样品。
7. 在室温下以1,600rpm（RCF = 390）离心细胞10分钟
8. 从细胞中除去上清液，并通过轻敲管子重悬沉淀
9. 轻轻地将沉淀重悬在1ml温热的benzonase培养基中。在室温下以1,600rpm（RCF = 390）离心细胞10分钟温度。从细胞中取出上清液并重悬沉淀通过点击管
10. 将细胞重悬于1ml温热完全RPMI中
11. 用Vicell（Vi-Cell XR Beckman Coulter）（或如果必要，血细胞计数器）。计数，取20微升细胞并用稀释 480μlPBS在vicell计数室中。作为PBMC加载到Vicell上 1:25稀释因子。
12. 用温热培养基（此时不再有benzonase）将细胞浓度调节至5×10 6个细胞/ml。
13. 使用多通道移液器，向96孔深孔板的8个孔的每个孔中加入100μl细胞（0.5×10 6个细胞）。
14. 在CO 2培养箱中于37℃静置另外1小时-1.5小时。在刺激之前准备刺激板。
  全板示例：
刺激细胞
1. 在新鲜的深井块中，在500μlRPMI中制备5x浓度的细胞因子。
2. 添加足够的5x细胞因子（〜500微升全板）到一排新鲜的深井块移液器。
  细胞因子刺激的实例：
  IFNa：使用的刺激的最终浓度= 10,000单位/ml
  IFNg2，IL6，IL7，IL10，IL21，IL2，IL17A：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
  CD3 =2.5μl，在990μl（终浓度500ng/ml）中在上述培养基终浓度（浓度2,000ng/ml）中CD28 =10μl LPS：使用的刺激的最终浓度=1μg/ml
  PMA 10ng/ml终浓度ml
  离子霉素1000ng/ml终浓度/ml
  IL5：使用的刺激的最终浓度= 10ng/ml
3. 从孵化器中取出深井块中的休眠细胞通过加入25μl的5x细胞因子用多通道移液器刺激每行患者样品。更改每个病人之间的提示。工作作为尽快。
4. 敲击板混合，并在37℃下在CO 2孵育器中孵育15分钟。
5. 删除细胞从孵化器在15分钟，并使用多通道移液管，加入20μl16％PFA（〜2.2％PFA终浓度）到每一行的深井块中的患者样品。吸移管向上和向下混合。更改患者之间的提示。在同一个添加PFA 您添加细胞因子刺激的顺序
6. 在室温下孵育10分钟。
7. 向深井块的每个孔中加入1.6ml CyFACS缓冲液。
8. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。细胞是固定/死亡，必须更难旋转以防止细胞丢失
9. 吸出细胞的上清液。
表面染色
1. 在金属螯合聚合物标记的表面的PBS中制备鸡尾酒抗体。充足每个样品的体积具有20μl的混合物。移入0.1μm 旋转过滤器并在台式微量离心机中离心（RCF = 14,000）在室温下搅拌5分钟
2. 加入20μl的抗体混合物到深孔板中的细胞，涡旋混合，并让其在室温下孵育30分钟。
3. 用CyFACS缓冲液和离心细胞以1.6ml /孔x2洗涤细胞在974rcf（em x g）在4℃下8分钟。通过抽吸弃去上清液。
4. 通过加入600微升-20°C冷MeOH通过细胞孔的深井块使用多通道移液器。吸取和下来混合为每个病人。更改患者之间的提示。
5. 细胞在这一点在-80℃下储存过夜
6. 从冷冻机中取出样品。
7. 以1ml /孔CyFACS缓冲液洗涤
8. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。抽吸弃去上清液。
9. 以1.8ml /孔的CyFACS缓冲液洗涤
10. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。通过抽吸弃去上清液。
细胞内染色
1. 在PBS的金属螯合聚合物标记细胞内的鸡尾酒抗体。使每个样品有足够的体积具有20μl的鸡尾酒。吸入 0.1μm旋转过滤器并在台式微量离心机（RCF = 14,000）在室温下处理5分钟
2. 加入20μl的抗体混合物到深孔板中的细胞，并让其在室温孵育30分钟。
3. 以1.8ml /孔CyPBS洗涤
4. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。抽吸弃去上清液。
5. 在Ir-嵌入剂的CyPBS中进行1：200稀释。加入20μl 稀释的Ir-嵌入剂溶液到每个孔中，用移液管混合。孵化冰20分钟。
6. 在MilliQ水中洗涤1.6ml /孔x 3。
7. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。抽吸弃去上清液。
8. 在标准仪器设置程序后，在CyTOF上采集样品。

代表数据

表面标记的选通

图1。健康对照PBMC样品中的细胞表面标记的门控

图2. 在具有多种刺激（US =未刺激）的CD4 ⁺和CD8 ⁺ T细胞中检测到的磷酸信号

笔记

染色体积保持在总共50至60μl。
洗涤步骤是最小化背景的关键。吸出使每次洗涤后仅剩约〜100μl体积。在下一次洗涤之前涡旋
通过上下移液彻底重悬，有助于均匀染色
样品稀释对于收集最佳数量的单细胞事件至关重要; 旨在约300次事件/秒。
不要将样品缓冲液或洗涤缓冲液暴露在空气中，因为灰尘积累会导致堵塞
每个样品应该重新悬浮在水中，并在运行之前通过尼龙网过滤; 不要让样品在水中过夜，因为细胞会溶解和结块，导致堵塞和事件的丢失。

食谱

完全RPMI（Hyclone RPMI-1640 Medium）
含10％FBS的RPMI
青霉素/链霉素
谷氨酰胺
CyFACS缓冲区
1x含有0.1％BSA的CyPBS PBS和0.05％叠氮化钠在MilliQ水中制造
注意：不要使用FBS！

致谢

这项工作得到来自美国国立卫生研究院的拨款S10RR027582,5U19AI057229和5U19AI090019的支持。

参考文献

Bendall，SC，Simonds，EF，Qiu，P.，Amir el，AD，Krutzik，PO，Finck，R.，Bruggner，RV，Melamed，R.，Trejo，A.，Ornatsky，OI，Balderas，RS，Plevritis ，SK，Sachs，K.，Pe'er，D.，Tanner，SD和Nolan，GP（2011）。跨越人类造血连续区的不同免疫和药物反应的单细胞质谱仪。 332（6030）：687-696。