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...

EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), suitable for cell culture (Sigma-Aldrich, catalog number: E6758)

pCAG- GFP (Addgene plasmid, catalog number: 11150) or pEGFP-N1 (Takara Bio Company, Clontech)

Plasmid and RCAS-DNA [the name RCAS stands for Replication-Competent ASLV long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor] (Note 6)

Morpholinos (Note 7)

NaCl (Fisher Scientific, catalog number: BP358-1) (MW 58.44 g/mol)

CaCl₂ anhydrous (Acros Organics, catalog number: AC34961-5000) (MW 110.98 g/mol)

KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-500）（MW 74.55g/mol）

Na 2 HPO 4无水二碱（Fisher Scientific，目录号：S374-500）（MW 141.96g/mol）

KH 2 PO 4无水二碱（Fisher Scientific，目录号：P290-500）（MW 174.18g/mol）

林格的解决方案（参见配方）

10x Hank's平衡盐溶液（HBSS）（参见配方）

快速绿色FCF（请参阅配方）

1 M Tris（见配方）

0.5 M EDTA（见配方）

质粒溶液的TE缓冲液（参见配方）

设备

斜边表玻璃（在电穿孔期间固定鸡蛋）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-355）
200μl无菌提示（Corning Incorporated）
用于显微注射的毛细管硼硅酸盐（1.0mm OD，0.5mm ID /纤维）[Frederick Haer& Co（FHC），目录号：30-30-1]
1ml注射器（Thermo Fisher Scientific）
预拉玻璃针头50毫米长，尖头直径20毫米，锐化10至12°（这些玻璃针按照Micropipette Puller和Micropipette Beveler的说明制作 - 图1d-e）
35mm塑料组织培养板（Corning Incorporated）
3/4英寸宽的透明胶带（Scotch，3M）
微切割镊子＃55和＃5（Roboz，目录号：RS-4984和RS-4978）
ECM 830高通量电穿孔系统（图1a），用于体外和体内电穿孔的方波脉冲发生器用远程操作脚踏开关（BTX，Harvard Apparatus，SKU： ECM_830_for_In_Vivo_Applications）
具有用于注射和填充的脚踏开关的微注射器（图1b），MicroJect 1000A（BTX，Harvard Apparatus，SKU：45-0705）和不锈钢移液管支架（图1c）
Micropipette beveler（Sutter Instrument Company，型号：BV-10）（图1d）
垂直微量移液器（Sutter仪器公司，型号：P-30）（图1e）
氮气罐压缩2.2 UN1066 NI NI230PP 230CF PP（CAGA580）（Weiler焊接）
立体变焦显微镜（Motic，型号：SMZ-168，目录号：1100200500322）或等效物
钨卤素光源（配备有光纤的系列，型号：8375）（Fostec ACE）
在37-39℃（99-103°F）和50-55％的相对湿度（83-87°F或28-31℃，在湿球温度计上）上校准的旋转培养箱（每小时角度旋转45°）（例如育种技术，1202E经典运动员， https：//www.gqfmfg .com/store/front.asp ）
孵化器热空气Hova-Bator（https://www.gqfmfg.com/store/front.asp）
200μl微量移液器
蓝光滤光片（直径12.5mm，〜100％透射率高达500nm）（Edmond Optics，目录号：52-530）
电极（注8）
1. Stage-8-12电极（设置见图2）
  1. 铂/铱（Pt/Ir）微电极单元3（Frederick Haer& Co，目录编号：UEPMEEVENNND），使用以下Metal Microelectrode Spec Sheet （ http://www.fh-co.com/uploads/files/ue-spec-2013.pdf ）订购
  2. 极端温度聚酰亚胺管（0.007"ID，1/16"，OD，0.08" Wall，1'L，Clear Amber，McMasterCarr，catalogue number：5707K12）
  3. 使用直径约2 mm和长度约3 mm的塑料支架（使用20μl移液管吸头制成）（见图2c1-2）
  4. 弯曲和停留302/304不锈钢丝（0.032"直径，1'长，McMASTER-CARR，目录号：6517K66）
  5. 精密微型不锈钢管，304不锈钢，15 规格，0.072"OD，0.05"ID，0.011"壁（McMASTER-CARR，目录号： 8988K31）
  6. 白色Delrin 缩醛树脂棒，3/8"直径（McMASTER-CARR，目录号：8572K53）。这种树脂棒是改性的具有压配合以在内部结合不锈钢管（材料#v）并且装配在用作a的聚碳酸酯管中手持器（材料#vii）（图1d）
  7. 耐冲击聚碳酸酯圆管（McMASTER-CARR，目录号：8585K11）
  8. 1米的26号（绞合的铝线）
  9. 连接器; BNC; 镀镍黄铜; 20; 镀金铍铜; PVC（Pomona，目录号：4969）
  10. 流动混合60秒（环氧树脂，1250psi强度，部件号：21445）（Devcon）
2. ectrodes（设置见图3）
  1. 一个genetrode套件（5毫米，镀金厚电极 - L形， ovo基因）（Harvard Apparatus，型号：512，目录号：45-0115）
  2. 一个铂/铱微电极单元3（Frederick Haer& Co，目录号：UEPMEEVENNND），参见来自阶段-8-12的部分"i" 订购指令的电极
  3. Tygon ^®微孔管（ 0.010"ID×0.030"OD，100ft/roll）（Cole-Parmer，目录号： EW-06419-00）（特性：极柔软，无毒; 无热原生物相容性）（Formulation Tygon，目录号： ND-100-80）
  4. 极端温度聚酰亚胺管.0089"ID， .0104"，OD，.0008"Wall（1L，Clear Amber）（McMaster-Carr， number：51085K42）
  5. 一个毛细管管硼硅酸盐显微注射，1.0mm OD，0.5mm ID /纤维（Frederick Haer& Co，目录号：30-30-1）
  6. 一个1ml移液管吸头（Corning Incorporated）
  7. 50厘米铝线（绞合），26规格
  8. 连接器; BNC; 镀镍黄铜; 20; 镀金铍铜; PVC（Pomona，目录号：4969）
  9. 流动混合60秒（环氧树脂，1250psi强度，部件号：21445）（Devcon）
    
    图1.电穿孔设备。电穿孔设备由ECM 830电穿孔仪（a），Microinjector MicroJect 1000A组成和不锈钢移液管支架（b，c），Micropipette Beveler和制造玻璃针（d，e）所需的拉拔器。

程序

鸡蛋操作和孵化
1. 在孵育之前，受精的无特异性病原体（SPF）（Charles River Laboratories，Wilmington）（注1）或白色来鸡鸡蛋（密歇根州立大学，East Lansing，MI）温度高达5天，生存力没有显着降低（80-85％存活率）或发育缺陷（注2）。
2. 孵化卵前，检查孵化器的条件（注3）。
3. 对于眼中的电穿孔，我们大约孵化蛋 35 h为阶段8-9（七个体节，前神经折叠关闭形成神经管），38 h阶段10（十个体节，视神经囊泡不收缩在基地），48 h阶段12（十六个体节，光学囊泡和视杆建立），72小时为阶段14（光学囊泡 evaginated和镜片placode存在）或4.5天为阶段22 [眼睛色素沉着，视网膜色素上皮（RPE）和神经上皮孔建立]（注4）。
  
  图2. 8-12电极设置。两个隔离的Pt/Ir电极与具有1mm的聚酰亚胺管（琥珀色管）的自由末端（a）如图所示弯曲（b）。此后，弯曲电极插入小塑料保持器（由20μl 移液管末端），直径约2 mm（c1），长度约3 mm（c2）尖端1.5mm之间（c）。电极插入保持器中由不锈钢管（SST）和树脂棒（RR）制成用压配合（d）修改。仔细地，电极是永久的使用环氧树脂附接到支架。保持形状和在该过程期间电极之间的距离为1.5mm（e）。最后，Pt/Ir电极连接到已经的电缆以前连接到电穿孔仪的BNC适配器
  
  图3. 19-26级电极设置。一个镀金厚电极（阳极+）用Tygon微孔管（a）隔离。一个Pt/Ir 微电极（阴极 - ）使用聚酰亚胺管（琥珀管），其具有1mm的自由末端（参见图2a）并插入玻璃中毛细管并用环氧树脂（b）密封，可替代地用1ml移液管吸头保护。然后组装电极连接到先前已连接到BNC的电缆电穿孔仪（c）的适配器
第8-12阶段的电穿孔
第8-12阶段的电穿孔
1. Once the eggs reach the desired stage, place them in a carton and at room temperature for about 10 min. This incubation is necessary to facilitate the contraction of the inner shell membrane and promotes the separation from the outer shell membrane to generate the air sack.
2. Keeping their horizontal position, place the eggs in a small incubator (e,g., HOVA-BATOR) previously calibrated at 37-39 °C (99 to 103 °F) and relative humidity of 50-55%.
3. With a bright light source, candle the egg and mark the area where the embryo is located, usually the embryo is located in the top part of the yolk (on the top of the horizontal section of the shell).
4. Mark the air sack that is located between the outer and inner membranes of the egg.
5. Pierce the shell at the top of the air sack using blunt ended forceps or a syringe with a large bore needle.
6. Carefully, introduce a fine probe to move the air sack to the top part of the egg, this is possible by gently touching down to lower the inner shell membrane (Figure 4b-c) (Note 5).
7. Using sharp curved scissors or blunt ended forceps, open a round window on the top of the embryo (around 2 cm of diameter) (Figure 4d) (Video 1 provides visual information of the steps B1e-h) and add 200 μl of HBSS. Close the window using transparent tape and return the egg to the incubator. Discard the embryos older than the desired stage. If the embryos have not reached the desired stage, they can be incubated for an additional time.
  在其中电穿孔的胚胎阶段的变化执行会对结果和解释产生不一致
8. 可选地，增强对比度和可视化胚胎阶段8-12，注射100微升稀释在HBSS中的印度油墨溶液，使用a 1毫升注射器和25-26号针在胚胎下面
9. 对其余的鸡蛋重复步骤B1e-h，直到十几个完成。
  
  图4.准备鸡蛋进行电穿孔。受精卵是在水平位置（a）温育。当地化了空气袋和鸡胚，一个细探针被引入将空气袋移动到蛋的顶部。这可以通过轻轻地触摸和降低内壳膜（b，c）。最后，使用锋利的弯曲剪刀钝端镊子，在胚胎的顶部打开一个圆窗（直径约2cm）（d）。
  
  视频1. 准备用于电穿孔的鸡蛋
胚胎电穿孔
1. 将氮气罐调整到80 psi
2. 将斜角玻璃毛细管针连接到微量注射器的不锈钢移液管支架（图1c）。
3. 将微注射器设置在18-20 psi，并执行测试加载HBSS 使用"填充"按钮或脚踏开关并释放解决方案从微注射器推动按钮"空"。测试使用脚踏开关的微注射系统
4. 附上蓝色二向色滤光片到钨卤素灯的光路资源。使用以下设置配置电穿孔仪：模式， LV; 电压，18V; 脉冲长度，50 ms; 脉冲数，5; 脉冲间隔，950ms; 极性，单极性
5. 将Stage-8-12电极（见设备部分）连接到电穿孔仪
6. 使用含有1ml HBSS的35mm组织培养板，检查电穿孔系统将电极放置在溶液中（注意 9）。
7. 使用微型注射器的脚踏开关，装载玻璃毛细管针与实验溶液（质粒，RCAS 构造或MO在解决方案部分）。
8. 添加100微升的HBSS胚胎，以减少电极之间的电阻
9. 对于电穿孔进入眼睛，注射0.25μl（20微注射脉冲使用20μm的尖端直径的玻璃毛细管针）溶液进入前神经折叠（前神经细胞在阶段8-9，图5a）或进入光学囊泡（阶段10-11，图5b）
10. 将阶段8-12电极放在卵黄膜上（一个清晰的在蛋黄周围的膜）在胚胎的两侧（平行于神经管）（图5a，b）并执行使用电穿孔器脚踏开关进行电穿孔
11. 小心地，删除电极，并添加额外100微升的HBSS
12. 用塑料胶带密封窗口并将蛋转移到孵育器直到它们达到期望的阶段。代表性的形象在阶段11使用对照MO（图5c，d）的电穿孔胚胎，并且3天后收集的数据如图5e所示
  
  图5。阶段8-12电穿孔。对于眼中的电穿孔，注射 0.25μl的实验溶液进入前神经折叠（在阶段8-9的前神经）（a）或进入视神经囊（阶段 10-11）（b）。在明亮的领域的代表性图片与印度墨水为在阶段电穿孔的胚胎的对比度（c）和荧光（d） 11使用控制MO。第12阶段电穿孔眼的共焦图像使用对照MO并在电穿孔后（e）收集24小时。 L：透镜，（e）中的比例尺=100μm。

在阶段19-26的视杯中电穿孔

将受精卵垂直温育直至达到所需阶段阶段8-12电穿孔。对于眼中的电穿孔，注射 0.25μl的实验溶液进入前神经折叠（在阶段8-9的前神经）（a）或进入视神经囊（阶段 10-11）（b）。在明亮的领域的代表性图片与印度墨水为在阶段电穿孔的胚胎的对比度（c）和荧光（d） 11使用控制MO。第12阶段电穿孔眼的共焦图像使用对照MO并在电穿孔后（e）收集24小时。 L：透镜，（e）中的比例尺=100μm。

在阶段19-26的视杯中电穿孔

将受精卵垂直温育直至达到所需阶段... Check the electroporation system placing the electrodes (1 cm in between) in a 35 mm tissue culture plate containing 1 ml of HBSS (Note 9).
Using the microinjector footswitch, load the glass capillary needle with the experimental solution (RCAS-DNA or morpholinos).
For electroporations in the eye, inject 0.5 µl (40 microinjection pulses) into the eye cup at Stage 18-19 or 0.75 µl (60 microinjection pulses) into the eye at Stage 24-25 using a 20 µm diameter tip glass capillary needle.
Add 200 µl of HBSS to the embryo to decrease the resistance between the electrodes.
To perform the electroporation, the gold plated electrode connected to the anode (+) is placed close to the ventro-temporal section of the eye and the cathode (-) electrode is inserted perpendicular to the head of the embryo (Video 2 essentially describes steps C8-10).

Video 2 . Electroporation in the chick optic cup at Stages 19-26
小心取出电极，加入200μlHBSS
用塑料胶带密封窗口并将蛋转移到孵育器直到它们达到期望的阶段。代表性胚胎在阶段25电穿孔的如图6所示

图6。第25阶段的电穿孔眼。第25阶段电穿孔眼的图像并使用对照吗啉（a）在24小时后收集。放大的电穿孔眼在（b）。显示的共聚焦图象电穿孔的神经上皮（NE）（c）。 RPE：视网膜色素上皮，L：晶状体。比例尺= 0.5mm（a），0.1mm（b）在（c）中为100μm。

笔记

对于将使用RCAS [具有剪接受体]复制能力的ASLV长末端重复（LTR）病毒系统的研究，我们强烈建议使用无特定病原体（SPF）的卵。这些卵已经被证明是没有禽肉瘤白血病病毒（ASLV）的病原体。有关其他信息，请参见http://www.criver.com/，McNally等人（2010）发表了关于ASLV病毒蛋白内源性表达的详细研究。
低于4°C的温度是有害的，因此在冬季运输期间要特别小心
将蛋在37-39℃（99-103°F）和50-55％的相对湿度下在旋转培养箱中孵育（每小时45度角旋转）。孵化时间和胚胎阶段可以根据培养箱的类型，温度和湿度而变化，因此特定胚胎阶段的孵育时间应该在每个实验室中经验地确定（Hamburger和Hamilton，1951）。
在进行电穿孔之前，确保胚胎处于期望的阶段，注意一些特征，例如体节数，视神经囊泡，晶状体囊泡和眼睛色素沉着的特征。电穿孔阶段的小差异可导致表型的巨大差异。在某些情况下，印度墨水的注入可能是必要的，以便可视化胚胎和熟悉结构（参见阶段8-12的电穿孔步骤B1i）。
在引入探针时要温和，避免损坏蛋的内膜。如果你注意到白蛋白的泄漏很可能是胚胎死亡
确保质粒或RCAS构建体具有高质量。使用市售试剂盒例如PureYield TM质粒Maxiprep系统或Qiagen Plasmid Maxi Prep TM扩增DNA构建体并溶解于TE缓冲液中（参见TE缓冲液在解决方案部分）。我们建议将DNA溶解在质量为3.0-5.0μg/μl和RCAS构建体的浓度为200 ng /μl，短期使用时保存在-20°C，长期保存在-80°C保存。避免使用含有痕量苯酚或乙醇和高浓度盐的DNA样品，因为它们可能对胚胎的生存能力有害。使用分光光度计或Nanodrop确定DNA的浓度。或者，可以使用SYBR Green I dsDNA测定法测定浓度。吸光度260/280的比例将给你一个关于DNA纯度与蛋白质或其他污染物的想法，次级测量可以是260/230（苯酚碳水化合物，吸光度接近230nm）（参见技术支持公告 http://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf ）。对于260/280比率〜1.8或更高的比率或对于260/230的2.0-2.2比率被认为是高质量的DNA。始终通过电泳验证DNA的完整性。定量不足以确保您的DNA具有良好的质量。对于第一次使用者，建议使用含有报道基因如GFP的质粒来评估电穿孔的效率，例如pCAG-GFP或pEGFP-N1。此外，为了跟踪您感兴趣的基因的表达，建议设计您的构建包括IRES-GFP序列或识别电穿孔区域的替代方法。为了制备电穿孔溶液，将9.0μl质粒（3.0-5.0μg/μl）或RCAS构成（200ng /μl）与1μl的0.05％Fast Green染料混合。

设计吗啉（MO）反义寡核苷酸以下调基因表达。它们可以从GeneTools LLC（http://www.gene-tools.com/）设计和订购。为了追踪电穿孔细胞，MO必须在3'-末端标记（例如羧基荧光素）。 MO具有最小的脱靶效应，但是为了观察相同的表型效应，推荐使用至少两种不同的MO（例如，阻断翻译和剪接连接）。另外，有必要使用靶mRNA的对照MO和/或加扰序列。使用MO的主要缺点是它们非常昂贵，有时需要测试两个以上的序列，以找到合适的MO有效地下调基因表达。此外，在细胞分裂期间，MO被稀释，因此它们长期（超过4天）是无效的，并且在一些情况下，它们在电穿孔72小时后几乎不可检测，并且在这种情况下，荧光信号需要使用抗体荧光素。 MO使用无菌林格氏溶液以1mM浓度溶解，并在室温下储存在原始容器中并保存在黑暗中。根据Gene Tools，MO可以在低温下沉淀并且失去其效率，因此它们需要在使用前再次重悬。在电穿孔期间，MO可能轻微地朝阳极（+）迁移，可能是因为带负电的荧光素。为了提高MO电穿孔的效率，建议使用0.5μgDNA（例如非生物活性质粒）。为了制备电穿孔溶液，混合并加热10μl的等分试样在65℃下10分钟以重新溶解沉淀物。不推荐使用快速绿色，因为它可以抑制电穿孔（Kos等人，2013）。可以使用附接到常规光纤灯的蓝色二向色滤光器来观察羧基荧光素标记的吗啉代的注射。

我们提供了设置Stage-8-12和Stage-19-26电极所需的部件列表，请注意，列出的某些部件可以相同。

按下电穿孔器脚踏开关后，您会看到电极上有轻微的气泡（气泡表示系统正常工作）。

食谱

林格的解决方案
1. 将7.2g NaCl，0.17g CaCl 2，0.37g KCl，0.115g Na 2 HPO 4和0.02g KH 2溶液 PO 4在900ml去离子水中的溶液
2. 用HCl调节pH至7.2，用去离子水调至1L 注意：最终浓度：NaCl 123mM，CaCl 2 2mM，1.53mM，KCl 5mM，Na 2 SO 4， 2
3. 使用0.2μmCorning一次性塑料真空过滤器过滤灭菌
4. 在-20℃下冷冻10ml的等分试样
10x Hank平衡盐溶液（HBSS）
1. 使用去离子水制备250ml的1×HBSS，并将pH调节至7.2
2. 使用0.2μmCorning一次性塑料真空过滤器过滤灭菌
3. 在-20℃下冷冻10ml的等分试样
快速绿色FCF
1. 使用去离子水制备0.05％（wt/vol）的储备溶液
2. 使用0.2μmCorning注射器圆盘型过滤器过滤灭菌
1 M Tris
将6.057g Tris溶解在30.0ml去离子水中，用1N HCl调节pH至8.0，用去离子水调至50.0ml。
0.5 M EDTA
将18.6g溶于80.0ml去离子水中，并用10N NaOH（EDTA溶解直到pH达到8.0）将pH调节至8.0，用去离子水调至100.0。
用于质粒溶液（10mM Tris，1mM EDTA，pH = 8）的TE缓冲液为了制备50ml TE缓冲液，将0.5ml 1M Tris（pH = 8）与0.1ml 0.5M EDTA（pH = 8）混合，用去离子水调节至50ml。通过高压灭菌器灭菌并在-20℃下冷冻2ml的等分试样

致谢

Michael Weeks，Jayson Alexander和Bill Lack，迈阿密大学仪器实验室在电极设置方面的帮助，Leah Stetzel对视频录制的帮助。这项工作由EY17319到KDRT，CONACYT 162930和142523到AL-M支持。该协议已经从我们以前的出版物Luz-Madrigal等人（2014）和Zhu等人（2014）中改编而来。

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