材料和试剂

龙胆（ Gentiana triflora ）组织培养苗
蔗糖
龙胆二糖（Sigma-Aldrich，目录号：G3000-5G）
结冷胶（Wako USA，目录号：075-03075）
液氮
Milli Q级水
MS维生素（见配方）
传播介质（参见配方）
IOWB感应培养基（参见配方）
龙胆中等（见配方）

设备

无菌洋红色盒（高压灭菌）
手术胶带（3M，目录号：1530-0）
玻璃培养管（高压灭菌）
硅胶塞（高压灭菌）
无菌15ml塑料管（例如Greiner Bio-One GmbH，目录号：188271）
无菌注射器过滤器（Millipore，目录号：SLGP033RS）
无菌培养皿（IWAKI PUMPS，目录号：SH90-20）
截止滤波器（Millipore，目录号：UFC5003BK）
生长室
清洁长椅
Scalpel
镊子
球磨机
离心机
冷冻干燥器

程序

龙胆IOWB和小植物的制备和龙胆二烯喂养
1. 根据Hosokawa等人的方法（1996）制备龙胆的体外苗培养物。
2. 传送拍摄提示（约1厘米）到包含的洋红色盒子 70ml的繁殖培养基并在20℃下培养1至2个月在16/8小时光/暗光周期下（图1A）
3. 转移3到5 （约1cm）加入到含有70ml水的品红盒中 IOWB诱导培养基（图1B），并在20℃下培养6个月以上在16/8小时光/暗光周期下（图1C）
4. 收获产生IOWB并使用a切成约2cm长的片解剖刀和镊子在塑料培养皿（图2A）
  
  图1。 IOWB从龙胆苗感应。 A.切割茎尖苗。 B.将枪头放置在IOWB诱导培养基上。 C. IOWBs 其由在IOWB诱导下培养6个月的龙胆子植物产生中。箭头表示IOWB。酒吧：2厘米
5. 转移IOWBs或植物到含有2ml龙胆二糖培养基的玻璃培养管并用硅插塞密封管的顶部（图2B）
  
  图2.将龙胆醇喂养到龙胆IOWB和小植物中。 A.收获的IOWB。 B.IOWB和芽尖放置在龙胆二糖上中。 C.IowB在龙胆二糖培养基上培养。 D.拍摄提示培养龙胆二糖培养基。酒吧：1厘米
6. 在20℃，16/8h光/暗光周期下培养适当的时间（图2C-D）。
7. 收获部分样品不与介质接触。
检测IOWB或小植物中的龙胆二糖
1. 在球磨机中冷冻干燥并粉碎IOWB或小植物
2. 用500μl50％（v/v）甲醇匀化10mg干重的样品
3. 将匀浆在20,000×g离心5分钟，并通过截止滤器过滤上清液。
4. 将滤液进行薄层色谱（图3）或其他分析以检测龙胆二糖
  
  图3.掺入龙胆中的龙胆二糖的实施例分析苗。从正常MS培养的小植株叶片中提取培养基（对照）或含有0.05％标记的龙胆二糖的MS培养基罗丹明（处理）3天进行TLC分析。 STD， 0.01％用罗丹明标记的龙胆二糖。

笔记

繁殖和喂养步骤应使用干净的工作台进行无菌操作。
标记的龙胆二糖只能用于确认并入的龙胆二糖
关于龙胆IOWB和小植物的细节，参见Imamura等人（2014）。
有关TLC分析的详细信息，请参见Takahashi等人（2014年）。
对于龙胆二糖标记，参见以下出版物Hase et al。（1978）和Fry（1997）。

食谱

MS维生素（100ml）
10g肌醇-6 50mg烟酸
50mg盐酸吡哆酮
10mg盐酸硫胺素 200mg甘氨酸
传播介质（1L）
4.6克MS盐
1 ml MS维生素
30克蔗糖 2g结冷胶
用KOH调节pH 5.7并高压灭菌15分钟
IOWB诱导培养基（1L）
4.6克MS盐
1 ml MS维生素
60克蔗糖 2g结冷胶
用KOH调节pH 5.7并高压灭菌15分钟
龙胆生物培养基（1L）
4.6克MS盐
1 ml MS维生素
10 g龙胆二糖或标记的龙胆二糖^*
2g结冷胶
用KOH调节pH 5.7并高压灭菌15分钟
^*在温度降至约60℃后，加入高压灭菌的MS培养基中。
^*标记的龙胆二糖用于确认掺入的龙胆二糖

致谢

该协议改编自以下出版物，Imamura等人（2014）和Takahashi等人（2014）。这项研究得到了教育，文化，体育，科学和技术部的青年科学家助学金（B）的支持。

参考文献

Fry，S.C。（1997）。糖基转移酶和糖基水解酶的新型"斑点印迹"测定：木葡聚糖的优化内切半乳糖苷酶（XET）活性。植物J（11）：1141-1150。
Hase，S.，Ikenaka，T。和Matsushima，Y。（1978）。用荧光化合物标记还原性末端糖对寡糖的结构分析。生物化学通讯（Biochem Biophys Res Commun）85（1）：257-263。
Hosokawa，K.，Nakano，M.，Oikawa，Y.and Yamamura，S。（1996）。来自Gentiana的商业栽培品种的叶，茎和根外植体的不定生殖再生>。 Plant Cell Rep 15（8）：578-581。
Imamura，T.，Higuchi，A.，Sekine，K.T.，Yamashita，T.and Takahashi，H。（2014）。高浓度的蔗糖诱导龙胆苗中越冬芽形成培养。植物生物技术 31（2）：97-104。
Takahashi，H.，Imamura，T.，Konno，N.，Takeda，T.，Fujita，K.，Konishi，T.，Nishihara，M.and Uchimiya，H。龙胆低聚糖龙胆二糖功能在草本多年生龙胆的芽休眠调节中的作用。植物细胞 26（10）：3949-3963。