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图1.敲除协议的一般概述

材料和试剂

Francisella tularensis ，包括subsp。（A型; 例如 SchuS4）或subsp。 holarctica （类型B; 例如 LVS）
注意：该方案已经证明可以在土拉拉杆菌菌株SchuS4，LVS和OR96-0246（B型）中起作用。所有菌株均可从BEI资源获得。
Trizol（Life Technologies，目录号：15596018）
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Life Technologies，目录号：11304-011）
pLG66a（Gallagher et al。，2008）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）
琼脂糖（Lonza，目录号：50004）
溴化乙锭，1％溶液（Fisher BioReagents，目录号：BP1302-10）
pTP163（suicide KO plasmid; Robertson等人，2013）
LB肉汤（Fisher BioReagents，目录号：BP1426-2）
甘油（Fisher BioReagents，目录号：BP2291）
Bacto琼脂（Becton Dickinson，目录号：214010）
潮霉素B溶液（50mg/ml）（Corning，目录号：30-240-CR）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27106）
Apa I限制性内切核酸酶（New England Biolabs，目录号：R0114L）
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289S）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
NEB-10β化学感受态。大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C3019I）
卡那霉素一硫酸盐（MP Biomedicals，目录号：194531）
GoTaq Green Master Mix（Promega Corporation，目录号：M7128-C）
分子生物学水，DNase，RNase和无蛋白酶（Corning，目录号：46-000-CM）
E。大肠杆菌菌株S17-1（Simon等人，1983;来自Drs。Michael Norgard和Greg Robertson，U.S.T.Western Medical Center，Dallas，TX的慷慨赠送）。
氯化钙脱水物（Fisher BioReagents，目录号：BP510-100）
Mueller Hinton肉汤粉（Becton Dickinson，目录号：211443）
胰蛋白胨（Fisher BioReagents，目录号：BP1421-500）
氯化钠（Fisher BioReagents，目录号：BP358-212）
IsoVitaleX富集（BD，目录号：211876）
葡萄糖（Fisher BioReagents，目录号：BP350-1）
焦磷酸铁（III）（Sigma-Aldrich，目录号：P6526-100G）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x，不含钙和镁（Corning，Mediatech，目录号：21040CV）
膜过滤器，0.025μm，25mm（EMD Millipore，目录号：VSWP02500）
血红蛋白粉（Neogen Acumedia，目录号：7195）
多粘菌素B硫酸盐（MP Biomedicals，目录号：100565）
氯化镁六水合物（Fisher BioReagents，目录号：BP214-500）
D-蔗糖（Fisher BioReagents，目录号：BP220-212）
氢氧化钠（Fisher BioReagents，目录号：BP359-500）
LB肉汤（见配方）
LB琼脂（见配方）
补充Mueller Hinton肉汤（sMHB）（见配方）
补充Mueller Hinton琼脂（sMHA）（见配方）
含有潮霉素和多粘菌素B的巧克力琼脂平板（见配方）
含有10mg/L卡那霉素和8％蔗糖（sMHA-kan10-suc）的sMHA（参见配方）

设备

Applied Biosystems Veriti 96-孔热循环仪或热循环仪， 3℃/秒
Thermo Scientific MaxQ 6000保温/冷藏可堆叠式振动器
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2孵化器

程序

底漆设计
引物设计是产生KO的最重要的步骤之一。首先，在相关的菌株基因组中找到您感兴趣的基因，并复制包含感兴趣的基因，您感兴趣的基因上游约1kb的DNA序列和感兴趣的基因下游1kb。为了证明该程序，FTL_1839-a< em> Francisella tularensis subsp。在该方案中，脂肪酶/酰基转移酶将用于引物设计和KO（图2A）。为了产生KO构建体，需要两个引物（命名为"A"和"B"）来扩增上游侧翼区，并且需要两个引物（命名为"C"和"D"）来扩增下游侧翼区。注意引物B和C必须分别位于目的基因的上游和下游，因为引物B和C之间的任何序列将被删除（图2A）。然而，引物A和D的位置更加灵活。而传统的细菌KO构建体含有1kb侧翼区，我们发现500bp侧翼区足以在F中启动同源重组和基因缺失。土耳其语。 500bp侧翼区的主要优点是它们比1kb侧翼区短，因此，在顺序PCR扩增步骤（如下所述）中，突变的机会较少。上游和下游侧翼区域中的引物长度和位置是相当灵活的，但是我们已经发现每种引物的最佳解链温度（Tm）应当在50℃和60℃之间。对于演示的FTL_1839KO构建体，每个引物的Tm在55和56℃之间（图2B-C）。熔解温度计算仅应基于与基因组序列同源的引物区，并且应排除工程化的限制性位点和其它引物修饰。当已经选择四个引物区时，应当通过添加基因组序列的5'端立即添加Apa I限制性位点（GGGCCC;图2C中的橙色核苷酸表示）来修饰引物A和D，应当向每个引物的5'末端添加随机核苷酸延伸以促进限制性消化效率（由图2C中的灰色核苷酸指示）。引物B和C的5'末端应被修饰以包括来自FLP重组靶（FRT） - 侧翼的Pfn-卡那霉素抗性盒（FRT-Pfn- k http://pepper.molgenrug.nl/index。 php /原核生物启动子），应用于分析您感兴趣的基因的隐蔽启动子。如果在所关注的基因中发现推定的启动子，则引物B和/或C的位置可能需要移动，使得推定的启动子在基因后保留删除。
第一轮PCR：扩增上游和下游侧翼区和卡那霉素抗性盒
1. 引物A，B，C，D，Kan5'和Kan3'应当悬浮在dH 2 O中，库存浓度为40μM。
2. F。土拉丁病基因组DNA应使用Trizol试剂制备，按照制造商的说明书，并悬浮于dH 2 O中。我们已经测试了其他基因组DNA提取技术和试剂盒，但在我们的经验，Trizol试剂产生最高质量的DNA（260nm/280 nm比在1.8和2.0之间）。
3. PCR扩增应该使用高保真Taq聚合酶（例如Platinum Taq DNA）进行聚合酶高保真（Life Technologies）.PCR反应通常含有0.2μM的每种引物和100-250ng的F。土耳其病毒 DNA
4. 在第一轮PCR扩增中，进行三个反应：
  1. 引物A和B用于从F扩增上游侧翼区。土拉热DNA（图3A）;
  2. 引物C和D用于从F扩增下游侧翼区。土拉热DNA（图3A）;
  3. 引物Kan5'和Kan3'用于扩增FRT-Pfn-kan-FRT 来自pLG66a（使用QIAprep Spin Miniprep纯化的质粒）使用提供的EB缓冲液洗脱; Gallagher等人，2008; 数字 3A）。
    PCR扩增应按照制造商的说明进行
    
    图2.用于生成FTL_1839 KO构建体的引物设计侧翼基因和FTL_1839（待缺失基因）的基因组组构，由大箭头表示。每个大箭头的方向表示开放阅读框方向。小黑箭头相关字母A，B，C和D表示的近似位置引物A，B，C和D需要产生上游和下游侧翼区。 B.E.土耳其语 subsp。 holarctica LVS基因组侧翼连接FTL_1839基因。上游基因FTL_1838是由绿色核苷酸字母表示。待缺失的基因，FTL_1839，由红色核苷酸字母表示。下游基因FTL_1840，用蓝色核苷酸字母表示。选择引物A， B，C和D由粗体和下划线核苷酸表示。 C。选择引物位置后，应修饰引物A和D. 以帮助克隆，并且引物B和C应当被修饰以包含的上游和下游之间的卡那霉素抗性基因区域。对于所有引物，土耳其语 subsp。 holarctica LVS 基因组序列由粗体和下划线核苷酸表示。对于引物A和D，在每个的5'末端的随机核苷酸延伸引物由灰色核苷酸字母和Apa I限制表示位点（GGGCCC）由橙色核苷酸字母表示。对于引物B 和C，分别是卡那霉素抗性的5'和3'末端基因（紫色中的核苷酸）已经添加到每个的5'端引物随后包含卡那霉素抗性基因两个侧翼区（如步骤4所述）。 D.引物Kan5'和用于扩增卡那霉素盒的Kan3'，FRT-Pfn-kan -FRT，来自 pLG66a。
5. 正确长度的产品应使用纯化 QIAquick PCR纯化试剂盒。对于产生的PCR扩增多条带，正确长度的产品应该从中切除琼脂糖凝胶上，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。或者，可以通过优化PCR扩增条件调整退火温度1〜5℃，提高PCR产物质量和数量
6. 正确长度的产品应进行纯化使用QIAquick PCR Purification Kit。对于PCR扩增导致多个条带，应当切除正确长度的产物从琼脂糖凝胶并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。或者，可以通过优化PCR扩增条件调整退火温度1〜5℃，提高PCR产物质量和数量。
第二轮PCR：剪接重叠延伸（SOE）PCR
使用SOE PCR（Horton等人，2013）融合AB上游侧翼区，FRT-Pfn-kan-FRT盒和CD下游侧翼区转化成称为"三脚架"的一个大扩增子（图3B）。
1. 如上所述，该PCR扩增应使用a 高保真Taq聚合酶，如Platinum Taq DNA Polymerase High 保真度。此外，快速温度梯度（> 3℃/sec）是因为三脚架的长度（大约2.5 kb）和难以将三个DNA片段退火成一个三脚架模板。
2. 对于SOE PCR反应，我们通常添加每个25ng/500bp 第一轮PCR产物与0.2μM引物A和D. 基于以前的结果，SOE PCR反应需要30至40％的Taq 聚合酶以产生足够的PCR产物用于随后的克隆
3. 推荐的SOE PCR扩增条件：
  1. 94℃2分钟
  --------------------------------
  2. 94℃30秒
  40-42℃45秒
  4.68℃3分30秒
  重复步骤2到4 6×
  -------------------------------
  5. 94℃30秒
  42-48℃45秒
  7.68℃3分30秒
  重复步骤5到7 24×
  -------------------------------
  8.68℃10分钟
  9. 4°C保持
  
  图3.三脚架PCR扩增和克隆到pTP163中。 A. A-B上游和C-D下游的第一轮PCR扩增侧翼区。土拉热杆菌基因组DNA和FRT-Pfn- kan -FRT 来自pLG66a。 B.二轮SOE PCR扩增融合 A-B上游侧翼区，FRT-Pfn-kan-FRT盒和C-D 下游侧翼区进入三脚架。 C. Apa I限制性消化的三脚架和自杀质粒pTP163，Antarctic Phosphatase 处理pTP163，并连接以产生KO质粒
4. 在SOE PCR扩增后，验证三脚架长度和纯度在含有琼脂糖凝胶上分离一部分SOE PCR反应溴化乙锭。对于演示FTL_1839 KO构造，预期的三脚架长度为2,484bp。正确长度的产品应该是使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。 SOE PCR扩增经常导致多个条带，因此正确尺寸的产品应该从琼脂糖凝胶上切下并使用QIAquick Gel纯化提取工具包。
  疑难解答备注：
  1. 基于总体三脚架长度（约2.5kb），PCR步骤4中的延伸时间理论上可以是2分钟至2分30秒。但是，我们已经发现较长的延伸时间（3分30秒）增加了三脚架产量和减少最终PCR产物中非特异性扩增子的量。
  2. 我们还发现，次优（低于Tm 2至6℃） PCR步骤3中的退火温度，随后的最佳退火 PCR中的温度步骤6增加三脚架产量并减少量的非特异性扩增子。我们假定较少严格的组装和三脚架的复制是必要的初始轮次的SOE PCR（PCR步骤2-4;图3B）但是更多在最后的SOE扩增步骤期间需要严格条件（PCR步骤5-7;图3B）用于高效和特异性三脚架代。 PCR步骤3-6中的退火温度需要仔细针对每个SOE PCR反应优化。
纯化自杀质粒pTP163
1. 同时完成上述步骤1至3，自杀质粒pTP163 （含有潮霉素抗性基因和sacB 蔗糖敏感性基因（Robertson等人，2013））应该纯化用于克隆。 pTP163 可以在任何标准E中转化和复制。大肠杆菌克隆菌株，例如DH5α。细菌菌种应在LB肉汤中制备含有15％甘油并储存在-80℃直至使用。
2. 板a 从冷冻库中小刮到含有200的LB琼脂平板上 mg/L潮霉素（LB-hyg平板），在37℃温育过夜，选择单菌落，接种到含有200mg/L的5ml LB肉汤中潮霉素，振荡孵育过夜（O/N），并纯化pTP163 使用QIAprep Spin Miniprep Kit。
在该步骤中，将三脚架（来自步骤3）和pTP163（来自步骤4）用用于克隆的Apa I消化（图3C）。为了在限制性消化后获得足够的产物，应当向每个反应中加入2μg三脚和2μgpTP163。限制性消化条件如下：
2μgDNA（pTP163或三脚架）
5μl10x CutSmart缓冲液
0.5μlApa I（New England Biolabs，50,000单位/ml，25单位）加入分子水至总量为50μl
在25℃孵育30分钟
在25℃下孵育30分钟后，只有三脚消化应使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。立即用 I-digested pTP163进行第6步。
南极磷酸酶处理pTP163
1. 在25℃下孵育30分钟后，立即进行Apa I消化 pTP163应在65℃热灭活20分钟。我们发现在Apa I限制性消化后，热灭活Apa I 以降低pTP163降解。
2. 以下热灭活，pTP163应用南极磷酸酶处理以避免自身连接（图3C）。添加以下南极磷酸酶成分加热灭活的pTP163管如下：
  1μl南极磷酸酶（5,000单位/ml，5单位）
  5.5微升10x南极磷酸酶反应缓冲液
  在37℃孵育1小时
3. 在南极磷酸酶处理后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化pTP163。
管道三脚架和pTP163
为了确保三脚架和pTP163（图3C）的成功连接，我们通常在同一时间进行三个单独的连接，其中三脚架与pTP163的比例不同（例如3:1,2:1，和1：1）。连接条件如下：
9μl三脚架（来自步骤5）和pTP163（来自步骤6）混合物
1μl10×T4DNA连接酶反应缓冲液
0.4μlT4 DNA连接酶（400,000单位/ml，160单位）在22℃孵育1小时
将KO构建体转化为标准E。大肠杆菌克隆菌株
每个连接产物应转化成E的标准克隆菌株的等分试样。我们通常使用NEB 10-beta感受态。大肠杆菌。转换过程如下：
1. 加入10微升的每个连接产物到20微升感受态E。大肠杆菌。
2. 轻轻混合细胞，并在冰上孵育30分钟
3. 在42℃热冲击30秒。
4. 将细胞放回冰上，立即加入1ml SOC培养基（包含在NEB 10-beta感受态大肠杆菌包装）。
5. 孵育转化的细胞在37°C，剧烈摇动1小时恢复
6. 将500μl转化物加到含有30mg/L卡那霉素（LB-kan30平板）的LB琼脂平板上，并在37℃下孵育O/N。
KO质粒纯化用于诊断性PCR和限制性消化
1. 过夜孵育后，选择最多五个单菌落（取决于对在平板上生长的菌落数）纯化和诊断筛选。
2. 接种每个殖民地到含有30mg/L卡那霉素的LB肉汤培养基中，孵育O/N 在37℃振荡，并使用QIAprep Spin Miniprep纯化质粒套件。
3. 我们通常使用GoTaq Green进行诊断PCR。确认卡那霉素抗性集落含有A-B上游侧翼区或C-D下游侧翼区，进行诊断性PCR （在该实例中，仅A-B上游侧翼区是放大）：
  1μl4μMPrimer A（0.2μM终浓度）
  1μl4μMPrimer B（0.2μM终浓度）
  0.5μl纯化的质粒（100-150ng）
  10μl2x GoTaq Green Master Mix
  加入分子级水至总体积为20μl
  PCR扩增应按照制造商的说明进行
4. 为了进一步验证卡那霉素抗性菌落含有全长三脚架，我们通常执行诊断消化纯化的质粒。诊断限制性消化条件为如下：
  500ng纯化的质粒
  2μl10x CutSmart缓冲液
  0.5微升 Apa I
  加入分子级水至总量20μl
  在25℃孵育30分钟至1小时
5. 诊断PCR和限制性消化应通过验证在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上分离产物。
DNA测序验证KO构建完整性
来自步骤9的通过诊断性PCR和限制性消化为阳性的质粒应被送去进行DNA测序以确认上游和下游序列的完整性。这对于确保没有突变被引入上游或下游侧翼区域是关键的。鉴于A-B和C-D侧翼区的相对短的长度，我们通常使用pTP163-5'和pTP163-3'引物进行DNA测序（图4）。引物pTP163-5'结合Apa I限制性位点上游117bp，而引物pTP163-3'结合Apa I限制性位点下游64bp。< br />

图4.用于验证KO构建体完整性的测序引物。引物pTP163-5'和pTP163-3'用于确认KO构建体的序列完整性。
将KO构造转换为 E。大肠杆菌菌株S17-1
E。大肠杆菌菌株S17-1是用于接合转移到弗朗西斯菌株的供体菌株。我们准备化学能力的。大肠杆菌 S17-1如下：
1. 将来自S17-1冷冻库的小刮片置于平原LB琼脂平板（无抗生素）上，并在37℃下孵育O/N。
2. 挑取单个菌落，接种到5ml平原LB肉汤（无抗生素）中，并在37℃下振荡孵育O/N。
3. 在4℃下将细菌在2,500×g下沉淀10分钟。
4. 将细菌沉淀悬浮在8ml冰冷的0.1M CaCl 2中并在冰上孵育30分钟。
5. 在4℃下将细菌在2,500×g下沉淀10分钟。
6. 将细菌沉淀悬浮在800μl含有0.1M CaCl 2和10％甘油的冰冷溶液中。
7. 准备50微升等分试样，存储在-80°C直到使用。
  转化化学能力的E。大肠杆菌 S17-1，混合20μl 化学感受态S17-1细菌与1μl纯化的KO质粒（约250ng;来自步骤9），并进行相同的转化方案，如步骤8中所述。在1小时恢复后，平板100μl 的变换的E。大肠杆菌S17-1细菌接种到LB-kan30板上在37℃孵育O/N。第二天，挑一个菌落，接种加入含有30mg/L卡那霉素的5ml LB肉汤中，并孵育O/N 在37℃振荡。第二天，O/N生长的一部分应存储在-80°C在15％甘油，而500微升的O/N 应节省用于缀合的生长（步骤12）。
结合
1. F。土伦氏杆菌制备。缀合前至少18至20小时，平板F. 土壤杆菌在补充的Mueller Hinton琼脂（sMHA）平板上（Huntley等人，2007），并在37℃下用5％CO 2孵育。天的共轭，刮掉所有的F。土壤杆菌生长从sMHA板和转移到含有500μl无菌PBS的1.5ml离心管中。使用P1000（或等效的）微量移液器，均匀悬浮细菌在PBS中。
2. E。大肠杆菌菌株S17-1制剂。使用新鲜生长 E的过夜培养物。来自步骤11的大肠杆菌S17-1细菌，沉淀500μl 在1,000×g下在4℃温育10分钟，并除去上清液。如果您的大肠杆菌 S17-1需要从冷冻库存种植，我们发现它最好首先将细菌连接到LB-kan30平板上，然后挑选单个菌落用于在含有30mg/L卡那霉素的LB肉汤中O/N生长。根据我们的经验，大肠杆菌S17-1冷冻库直接接种 O/N LB肉汤导致接合效率差。
3. 膜过滤器放置。使用无菌镊子，放置0.025μM膜过滤器在sMHA板的中心。轻轻敲打膜上琼脂表面以确保接触
4. 混合。土耳其语和S17-1。转移50微升的F。土拉/灌浆悬浮液管。来自步骤12b的大肠杆菌S17-1沉淀物。使用P100（或等效）微量移液器，轻轻吸上下5〜10次挂起 E。大肠杆菌S17-1细菌并制备均匀的悬浮液用 F。土耳其语。基于以前的经验和细菌枚举研究，理想的F的比值。土耳其语到 E。大肠杆菌 S17-1 约为10：1。
5. 共轭孵育。转移细菌混合物到达膜过滤器的中心从步骤12c。孵育sMHA板，膜侧向上，在30°C 5％CO 2的水溶液16至24小时。较低的温育温度是必要的那个。大肠杆菌 S17-1不会过度生长。土耳其语孵化。
KO构造集成的共轭恢复和选择
1. 在30℃下孵育16至24小时后，使用无菌镊子将膜过滤器转移到50ml锥形管中，并洗涤细菌离开膜过滤器使用800μl的无菌PBS。
2. 将整个洗涤体积转移到含有巧克力琼脂平板上 200mg/L潮霉素和100mg/L多粘菌素B，并均匀铺展接种物在板表面上。
3. 孵育巧克力琼脂板在37℃，5％CO 2下颠倒3至4天，或直至菌落开始出现。此步骤的目的是针对大肠杆菌 S17-1进行选择，并选择 F。土耳其人菌落（ f。tularensis is 相对抗多粘菌素B）构造。
对含有KO构建体的菌落的卡那霉素选择
当在巧克力琼脂平板上可见集落时，挑取单个菌落并划线到含有10mg/L卡那霉素（sMHA-kan10）的sMHA平板的单独象限上。我们通常选择8个菌落用于卡那霉素选择。在37℃下用5％CO 2孵育24小时。该步骤的目的是选择已经将自杀性质粒pTP163（包括KO构建体）整合到基因组中的菌落（1 重组步骤）。
卡那霉素和蔗糖选择含有KO构建体的菌落
1. 孵化24小时后，单个菌落很少可见。将来自sMHA-kan10平板的细菌生长转移至sMHA 其含有10mg/L卡那霉素和8％蔗糖（sMHA-kan10-suc）。
2. 细菌时获得更好的结果生长从sMHA-kan10板是严重划线的象限 sMHA-kan10-suc板，因为这个选择步骤是严格的和可能的杀死许多细菌。
3. 单菌落很可能出现在2到4 天在sMHA-kan10-suc板上。这一步的目的是迫使从基因组中释放自杀性质粒（2 nd 重组步骤），导致卡那霉素抗性盒的缺失（不期望的结果）或感兴趣的基因（优选结果）。
4. 只有保留自杀质粒的菌落，以及因此sacB /蔗糖敏感性基因，将是蔗糖敏感的。
复制电镀选择潮霉素敏感和卡那霉素抗性菌落
在sMHA-kan10-suc板上孵育2至4天后，使用牙签挑选对卡那霉素和蔗糖都具有抗性的菌落，并以下列顺序将其复制在两个单独的平板上：
1. sMHA含有200mg/L潮霉素（sMHA-hyg;以确保菌落对潮霉素敏感）
2. sMHA-kan10;以确保菌落具有卡那霉素抗性）将单个菌落大量划线到每个的预先标记的象限上并在37℃下用5％CO 2孵育2至3天。无菌在这个步骤中使用牙签，因为菌落太小而不能用接种环挑选。只有殖民地卡那霉素抗性和潮霉素敏感性应视为潜在KOs。这些菌落应重新划线到新鲜 sMHA-kan10平板，孵育1天，悬浮于sMHB中，并储存于37℃ -80°C，直到使用。
  疑难解答注意事项：蔗糖抗性菌落（来自步骤15），其保持潮霉素抗性（来自步骤16）通常发生并且是赋予的抑制突变的结果蔗糖抗性。潮霉素抗性菌落不应进一步筛选，因为它们仍然包含未解决的自杀质粒。我摔倒菌落在步骤16后是潮霉素抗性的，更单一菌落应当在步骤15中选自sMHA-kan10-suc平板并复制铺板到sMHA-hyg和sMHA-kan10上，如步骤所述 16.如果卡那霉素抗性和潮霉素敏感性菌落仍然存在不能在步骤16之后获得，我们建议从开始共轭（步骤12）。根据我们的经验，共轭可以重复到三次以增加选择KO的机会。但是，如果不能获得卡那霉素抗性和潮霉素敏感性菌落经过三次共轭，这可能表明你的基因是必要。
诊断PCR以确认KOs
1. 应进行诊断PCR以确认卡那霉素抗性和来自步骤16的潮霉素敏感性集落是真正的KOs。
2. 基因组DNA应通过放置卡那霉素抗性菌落来制备在50μl50mM NaOH中，将溶液煮沸10分钟，短暂离心以沉淀不溶性材料，并转移上清液至新的微量离心管。
3. 我们通常进行3个单独的PCR反应以验证卡那霉素抗性集落是实际的KO（图5）。
4. 诊断PCR反应如步骤9所述进行，通常包含0.5μl的基因组DNA，并且包括以下引物对：
  引物A和D
  引物A和Kan3'
  引物Kan5'和D
  如果你感兴趣的基因已从潜在的KO菌落中删除，所有三个引物对应扩增特定大小的目标基因组DNA。然而，如果引物对A和D是唯一的引物从潜在的KO殖民地放大目标，然后这个殖民地不太可能是KO。根据我们的经验，潜在KO不大可能集落（卡那霉素抗性，蔗糖抗性，潮霉素敏感性）将由所有三个引物对阴性。然而，PCR条件需要仔细优化以获得具有所有三种引物的扩增子对。
  
  图5.确认KO候选人的诊断PCR。三使用PCR引物对来确认您的目标基因被卡那霉素抗性盒取代：引物对A-D，A- Kan3'和Kan5'-D。

代表数据

SOE PCR
SOE PCR反应通常导致不是正确大小的非特异性产物（图6A）。然而，优化的SOE PCR反应可以扩增没有非特异性条带的正确长度的三脚架（图6B）。如果SOE PCR不能通过退火温度的变化优化，可以如步骤3中所述进行凝胶纯化

图6.SOE PCR代表性数据 A.泳道1和2是导致特异性（3,400bp）和非特异性（2,400bp）三脚架带的典型SOE PCR反应的实例; B.泳道3和4是优化的SOE PCR反应的实例，其中产生正确的长度三脚（2,400bp），并且不存在非特异性条带。 L表示在每个凝胶左侧注明的DNA梯度
诊断PCR以确认KO
在步骤17中进行诊断PCR以确认来自步骤16（图7）的KO候选物。在该实施例中，仅引物对A-D扩增来自野生型基因组DNA的产物。然而，所有三个PCR引物对扩增来自KO候选物的产物。在该实施例中，来自wt和KO基因组DNA的A-D引物对产物具有大致相同的大小，因为感兴趣的基因和卡那霉素抗性盒是大致相同的大小。因此，并不是所有的诊断PCR结果都类似于这个例子

图7.用于确认KO的诊断PCR 泳道1-3是从WT基因组DNA扩增的PCR产物。泳道1，引物对A-D。泳道2，引物对A-Kan3'。泳道3，引物对Kan5'-D。泳道4-6是从KO候选基因组DNA扩增的PCR产物。泳道4，引物对A-D。泳道5，引物对A-Kan3'。泳道6，引物对Kan5'-D。 L表示在凝胶左侧注明的DNA梯度。

食谱

LB肉汤（1L）
25g LB肉汤粉末
溶解在1L去离子水中
高压灭菌45分钟
LB琼脂（1L）
25g LB肉汤粉末
溶解在1L去离子水中
加入16g Bacto琼脂
高压灭菌45分钟
将LB琼脂倒入100mm×15mm培养皿中，每板20ml。
通过在即将倒入板之前将上述量的卡那霉素加入到上述配方中制备LB-kan30板（含有30mg/L卡那霉素）。我们制备100 mg/ml卡那霉素储备液（-20°C储存）用于此目的通过在倾倒板之前立即向上述配方中加入指定量的潮霉素来制备LB-hyg平板（含有200mg/L潮霉素）。 50mg/ml潮霉素的储备溶液是可商购的
补充Mueller Hinton肉汤（sMHB）（1 L）
21克Mueller Hinton肉汤粉
210mg MgCl 2
182mg CaCl 2
溶解在1L去离子水中
高压灭菌45分钟（在装有培养基的瓶子中保持搅拌棒）
可以在室温下储存长达一个月。在使用前，请添加：
20 ml IsoVitaleX富集
10ml 10％葡萄糖 10ml 2.5％焦磷酸铁
补充的Mueller Hinton琼脂（sMHA）（1L）
21克Mueller Hinton肉汤粉末
10克胰蛋白胨
5克氯化钠
溶解在1L去离子水中
加入16g Bacto琼脂
高压灭菌45分钟（在装有培养基的瓶子中保持搅拌棒）
冷却至50°C，并在倾倒板之前立即添加以下组分：
25 ml供体小牛血清
20 ml IsoVitaleX富集
10ml 10％葡萄糖 10ml 2.5％焦磷酸铁
将sMHA倒入100mm×15mm培养皿中，每个平板约20ml sMHA-kan10平板（含有10mg/L卡那霉素）通过在即将注入平板之前将上述量的卡那霉素加入到上述配方中制备。我们制备100 mg/ml的卡那霉素储备液（-20°C储存）用于此目的 sMHA-hyg平板（含有200mg/L潮霉素）是通过在倾倒平板之前立即向所述配方中加入指定量的潮霉素制备的。 50mg/ml潮霉素的储备溶液是可商购的
含有潮霉素和多粘菌素B的巧克力琼脂平板在一个容器中，准备：
21克Mueller Hinton肉汤粉末
10克胰蛋白胨
5克氯化钠
溶于750ml去离子水中
加入16g Bacto琼脂
高压灭菌45分钟（在装有培养基的瓶子中保持搅拌棒）
在第二个容器中，通过以下方式制备4％血红蛋白溶液：
将12g血红蛋白溶于300ml去离子水中
高压灭菌45分钟
高压灭菌后，立即向高压灭菌的Mueller Hinton溶液中加入250ml的4％血红蛋白溶液，搅拌1分钟，制成1L巧克力琼脂混合物冷却至50°C，并在倾倒板之前立即添加以下组分：
10 ml IsoVitaleX富集
200mg/L潮霉素 100mg/L多粘菌素B
将巧克力琼脂倒入100mm×15mm培养皿中，每个平板约20ml
含有10mg/L卡那霉素和8％蔗糖（sMHA-kan10-suc）的sMHA 21克Mueller Hinton肉汤粉末
10g胰蛋白胨
5克氯化钠
溶于800ml去离子水中
加入16g Bacto琼脂
高压灭菌45分钟（在装有培养基的瓶子中保持搅拌棒）
冷却至50°C，并在倾倒板之前立即添加以下组分：
25 ml供体小牛血清
20 ml IsoVitaleX富集
10ml 10％葡萄糖 10ml 2.5％焦磷酸铁（III）
10mg/L卡那霉素
200ml 40％蔗糖将sMHA-kan19-suc倒入100mm×15mm培养皿中，每个平板约20ml。

致谢

我们感谢博士。德克萨斯大学西南医学中心的Michael Norgard和Gregory Robertson友好地提供原始的方案和试剂以产生F。土壤杆菌基因缺失。我们感谢博士。华盛顿大学的Larry Gallagher和Colin Manoil热情地提供pLG66a。这项工作得到国家卫生研究院的过敏和传染病国家研究所的支持，授予K22AI083372和R01AI093351，J.F.H。内容完全是作者的责任，并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

参考文献

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