材料和试剂

根据Boavida和McCormick（2007）的拟南芥 day-0花
注意：选择在花序茎顶部打开的最后一个花序芽。雄蕊不得高于柱头。
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F0804）
山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：S4521）
针对植物细胞壁多糖/糖蛋白的初级抗体（ http://www.plantprobes.net 或 http://www.ccrc.uga.edu/~carbosource ）或双半乳糖基二酰基甘油（DGDG）在实验室中使用纯化的DGDG 作为抗原
缀合到Alexa Fluor 488（Life Technology，目录号：A-11008）或异硫氰酸荧光素（FITC）（Sigma-Aldrich，目录号：F0382）的二级抗体
拟南芥花粉萌发培养基（PGM）（参见Recipes）
1×Tris缓冲盐水（TBS）（见Recipes）
固定解决方案（参见配方）
无钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（CMF-DPBS）（参见配方）
阻止缓冲区1（请参阅配方）
阻止缓冲区2（参见配方）

设备

双镊子
Olympus CK2倒置显微镜
显微镜Zeiss AxiObserver Z1
注射过滤器PVDF 33mm0.2μm
微量离心机（VWR ^TM Galaxy 14D）
NucleosSpin质粒结合柱（Macherey-Nagel，目录号：740588.50），但可以使用任何其它试剂盒（Genejet或PureLink）的柱。
22℃和30℃的培养箱
Parafilm ^®
共聚焦显微镜TCS-SP2操作系统（Leica）和显微镜Leica DMI6000B与具有FITC滤光器的DFC450C照相机（吸收，485-520nm;发射，520-560nm波长

程序

体外拟南芥花粉管生长和固定
注意：另见Li（2011）提供的协议。但我们建议使用以下方案中详述的条件（花数，PGM体积，温度），以提高重现性。
1. 根据Boavida和McCormick（2007）描述的方法，在体外生长拟南芥花粉。
  1. 使用一对镊子收获40新鲜开放的拟南芥花（早上是最好的）。
  2. 浸入1ml PGM在1.5ml Eppendorf管中。
  3. 大力手动和用涡旋摇动管5分钟，以从花药释放花粉粒。
  4. 用倒置显微镜检查花粉数密度。
  5. 用一对镊子去除所有的花碎屑。
  6. 使用微量离心机在3,200×g下旋转花粉悬浮液7分钟（微黄色颗粒应该是可见的）。
  7. 通过吸移除去上清液。
  8. 加入250微升PGM并重悬沉淀
  9. 将管水平放置在孵化器中在22°C在黑暗中6小时。
  10. 6小时后，用倒置显微镜检查花粉萌发和花粉管生长（图1）。
    
    图1. 6 h-old拟南芥花粉管。请注意，花粉粒密度对于获得良好的花粉萌发率是重要的。
花粉管固定和免疫标记
注意：下面描述的协议改编自Bottéet al。（2011）和Dumont et al。（2014）分别为花粉膜和花粉细胞壁标记。可以通过将NucleoSpin 质粒结合柱连接到真空如吸水器（图2）在微量离心机中以300×g离心1分钟。在抽吸法中，弃去流出液，将存在于二氧化硅膜上的发芽的花粉轻轻地再悬浮于适当的缓冲液中。尽管非常相似，两个方案不同，另外的透化步骤用于花粉管膜标记（步骤B4）和使用不同的缓冲液（图4）。用于细胞壁标记的缓冲液（Dumont等人，2014）写在括号之间。

图2. NucleoSpin ^® 连接到软管的质粒结合柱
1. 将PGM中的花粉管与含有固定介质的（v/v）混合 5％甲醇的TBS缓冲液（或5％固定溶液）。将花粉管在4℃下孵育过夜使用（不要存储花粉管超过1个月）。
2. 将花粉管溶液转移到保持在收集管上的通风管下的NucleoSpin 质粒结合柱上。
  注意：执行以下所述的所有传送和所有清洗步骤其尖端距离其末端0.5厘米，以避免花粉管损伤（这样即可使用大口径移液器吸头在这里： http://www.thomassci.com/Supplies/Pipettor-Tips/_/200l-Clear-Wide-Bore-Pipet-Tips?q=Wide%20Tip%20Pipet 或 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=T-205-WB-C%28Lifesciences%29&categoryname= ）。
3. 通过抽吸或离心和洗涤去除介质用100μlTBS缓冲液（或CMF-DPBS，两者均在0.22下过滤）洗涤三次 μm。将花粉管轻轻地重悬在中缓冲液通过上下吹吸，缓冲液被去除抽吸/离心。
4. 用柱子密封柱底部 parafilm ，并在TBS中加入100μl0.002％皂苷15分钟用于花粉膜渗透（跳过此步骤，下一个用于细胞壁免疫标记）
5. 通过抽吸/离心去除培养基
6. 用parafilm 密封柱的底部并孵育花粉管中新鲜地加入100μl封闭缓冲液1（或封闭缓冲液2）制备，1小时。
7. 通过抽吸/离心去除阻塞缓冲液。
8. 细胞壁标记需要用CMF-DPBS洗涤三次解释在步骤B3（跳过此步骤为膜免疫标记）。
9. 密封柱底部，加入50μl一级抗体1:10 稀释DGDG特异性兔血清在TBS-1％FBS-0.002％皂苷和在室温孵育1小时（或细胞壁标记：1:20 一抗在CMF-DPBS中4℃过夜）。阴性对照是通过省略初级抗体制备
10. 如步骤B3中所述用TBS-1％FBS-0.002％皂苷（或CMF-DPBS）洗涤三次。
11. 密封柱的底部，加入50μl1:500稀释的Alexa 二抗在TBS-1％FBS-0.002％皂苷中，室温孵育1小时温度（或对于细胞壁标记：FITC偶联的抗体在CMF-DPBS中1:50稀释在30℃下2小时）。
  注意：从这一步，保持管在黑暗的铝箔。
12. 在TBS-1％FBS-0.002％皂苷中洗涤四次，最后一次洗涤 TBS（或CMF-DPBS的五次），如步骤B3中所解释
13. 在为了恢复花粉管，通过在顶部添加重悬它们的柱100μl的TBS（或水），并通过上下吹吸几次用放大的尖端和转移的解决方案包含具有盖玻片的显微镜载玻片上的花粉管。图3显示了显示结果的共焦图像用抗DGDG对拟南芥花粉管的免疫荧光标记。图4给出了膜或细胞壁的方法的概述花粉管的免疫标记
  
  图3. 拟南芥花粉颗粒发芽6小时，花粉管固定，花粉管膜与抗DGDG抗体免疫标记。 Alexa 488兴奋使用488nm线的氩激光并收集荧光在500-539nm之间。对照红色自发荧光的叠加还示出了由在543nm激光下的激发诱导的
  
  图4。拟南芥花粉管质膜和细胞壁免疫标记的样品制备的示意图。绿色虚线框表示用于质膜标记的特殊步骤或缓冲液而蓝色虚线框指出细胞壁的步骤标签。图像底部的图片显示花粉管用抗鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（果胶基序）抗体标记由Matoh等人（1998）使用显微镜Leica DMI6000B开发装备有DFC450C相机（FITC过滤器：吸收，485-520nm; 发射，520-560nm波长）。

食谱

拟南芥花粉萌发培养基（PGM）
5mM CaCl 2
0.01％H 3 BO 3 sub。 1mM MgSO 4 5 mM KCl
10％（w/v）蔗糖 pH 7.5
1×Tris缓冲盐水（TBS）
50mM Tris-HCl
150mM NaCl pH 7.4
固定溶液
100mM PIPES缓冲液pH6.9
4mM MgSO 4 7H 2 O 2·h/v 4mM EGTA
10％（w/v）蔗糖 5％（v/v）多聚甲醛
无钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（CMF-DPBS）
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
7mM Na 2 HPO 4 7H 2 O 2 1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v pH 7.2
阻塞缓冲区1
1x TBS
5％（w/v）FBS
5％（w/v）山羊血清 0.002％皂苷
阻塞缓冲区2
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
7mM Na 2 HPO 4 sub 7H 2 O 1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v pH 7.2
3％无脂牛奶
注意：最好使用注射器过滤器过滤所有洗涤溶液的0.22μm。

致谢

方案的原始版本描述于Dardelle等人（2010），Botté等人，（2011）和Dumont 等人（2014）。这项工作得到鲁昂大学，区域Haute Normandie和"INTER ChannelEGETA"项目选择的"Trans Channel Wallnet"项目的支持，该项目由法国（频道） - 英国欧洲跨境合作计划选定，该计划由联合资助欧洲区域发展基金（ERDF）。在LPCV（Grenoble）进行的工作由Agence Nationale de la Recherche（ANR-10-BLAN-1524，ReGal; ANR BioAdapt Reglisse）支持。

参考文献

博瓦维达和McCormick，S。（2007）。技术进步：温度作为增加和可再现性的决定性因素< （3）：570-582。
Botté，CY，Deligny，M.，Roccia，A.，Bonneau，AL，Saïdani，N.，Hardré，H.，Aci，S.，Yamaryo-Botté，Y.，Jouhet，J.，Dubots， Loizeau，K.，Bastien，O.，Bréhélin，L.，Joyard，J.，Cintrat，JC，Falconet，D.，Block，MA，Rousseau，B.，Lopez，R。，和Maréchal，）。拟南芥中单半乳糖基二酰基甘油合成酶的化学抑制剂 < Nat Chem Biol 7（11）：834-842
Dardelle，F.，Lehner，A.，Ramdani，Y.，Bardor，M.，Lerouge，P.，Driouich，A.and Mollet，J.C。（2010）。拟南芥花粉管细胞壁的生化和免疫细胞表征。 Plant Physiol 153（4）：1563-1576。
Dumont，M.，Lehner，A.，Bouton，S.，Kiefer-Meyer，M.v.C。，Voxeur，A.，Pelloux，J.，Lerouge，P.，and Mollet，J.C。（2014）。细胞壁果胶聚合物rhamnogalacturonan-II是正常花粉管延长所必需的：推定的唾液酸转移酶like protein。 Ann Bot 114（6）：1177-1188。
PlantProbes： http://www.plantprobes.net
CarboSource服务： http://www.ccrc.uga.edu/~carbosource
Li，X.（2011）。拟南芥花粉管萌发生物协议 Bio101：e73。
Matoh，T.，Takasaki，M.，Takabe，K.，and Kobayashi，M.（1998）高等植物细胞壁中鼠李聚糖半乳糖醛酸II的免疫细胞化学。植物细胞生理学39：483-491。