材料和试剂

脱氧核苷三磷酸（Roche Diagnostics，目录号：11969064001）
γ-[sup-32P] ATP（PerkinElmer，目录号：Blu502A001MC）
G-25宏旋转柱（最适合体积为75-150μl）（哈佛仪器，目录号：74-3901）
40％丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺（19:1）溶液（VWR International，目录号：JT4969-0）
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201L）
10X T4多核苷酸激酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0201S）
尿素（VWR International，目录号：97061-926）
过硫酸铵（VWR International，目录号：97064-594）
HIV逆转录酶，如Hou等人（2004）所述纯化，
DNA DNA寡核苷酸
1. 模板：
  5'-GGGCGAATTTAG [ G/C TTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTG G-3'。括号中带下划线的核苷酸表示模板在该位置可以使用G或C，这取决于类型的错配。
2. 引子：
  5'-TAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAX-3'。引物3'端的"X"表示A，T或C. 失配检查。在匹配引物的情况下，"X"是G.
1 M MgCl 2
延伸反应缓冲液（参见配方）
2x加载染料（参见配方）

设备

Eppendorf管
微量移液器
台式离心机
孵化器
凝胶装置

软件

Sigmaplot版本10.0（Sysstat软件）

程序

引物标记
1. 所有引物应首先在50μl的1×PNK缓冲液中以及50皮摩尔每种引物，10μl[γ-32 P] ATP和5单位PNK进行放射性标记。
  注意：将反应混合物在37℃下孵育30分钟，并将PNK在65℃下热灭活15分钟。
2. 将G-25离心柱与500μldH 2 O孵育15分钟以平衡柱，并且通过在台式离心机中以5,000rpm离心4分钟来除去水。
3. 在热失活后，通过将其装载到平衡的柱上并以5,000rpm旋转4分钟，从反应混合物中除去过量的[γ-32P] ATP。
匹配引物延伸反应
要获得有关标准延伸效率的信息，应进行匹配引物和错配引物的延伸。然后标准延伸效率可以计算为延伸错配引物的效率与延伸匹配引物的效率的比率
1. 建立了8个匹配的引物延伸反应。对于每个反应，将14nM的放射性标记的引物与14nM的模板（引物：模板的1:1比例）在7μl的延伸反应缓冲液中杂交。将混合物在65℃下加热5分钟，然后缓慢冷却至室温。
2. 然后将杂交体与2μl的10mM MgCl 2（终浓度为2mM MgCl 2）和2μl的10mM MgCl 2溶液一起在37℃下在反应缓冲液中孵育3分钟。 μl的核苷酸底物（每种反应的浓度不同，见下文）。核苷酸底物是待添加的下一个正确核苷酸，并且其取决于反应中使用的模板。对于该特定模板，dCTP是底物（图1）。对于匹配的引物延伸反应，八个反应的dCTP终浓度分别为0,0.02,0.04,0.1,0.2,0.3,0.6和1μM。
  
  图1.在错配引物延伸测定中使用的构建体。 DNA模板的序列显示在底部，引物的序列显示在顶部。加下划线的核苷酸显示两个模板之间的唯一区别。
3. 然后通过加入2μl13nM HIV RT（2nM终浓度）引发延伸。总反应体积为13μl。
4. 2分钟后，通过加入13μl2x加载染料终止反应注意：反应仅进行2分钟以确保引物仅延伸一个核苷酸。
5. 然后将反应产物在16％变性7M尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥，并使用Fujifilm FLA5100磷光计成像。
  注意：样品运行足够远，以从引物条带中分离扩展条带（图2）。
引物延伸反应不匹配
1. 对于错配的引物延伸反应，使用不同的放射性标记的引物，这取决于分析的错配（图1）。如上所述制备引物模板杂交体。
2. 建立了八个单独的反应。将7μl引物 - 模板杂交体在37℃下在反应缓冲液中与2μl10mM MgCl 2（终浓度为2mM MgCl 2）一起温育3分钟>）和2μl核苷酸底物。总反应体积为13μl 注意：不匹配的引物 - 模板序列比匹配的引物 - 模板序列需要更多的延伸底物。因此，八个反应的dCTP最终浓度分别为0,50,100,200,400,630,1,200和1,870μM（图2）。
3. 通过加入2μl13nM HIV RT启动延伸。
4. 延伸5分钟后，通过加入13μl2x加载染料终止反应，并且如上所述在16％变性聚丙烯酰胺凝胶上处理延伸产物。凝胶在75瓦下运行90分钟。
  
  图2.错配引物延伸测定的代表性数据。此处使用的引物：模板杂交体在3'末端具有C.A错配。在每个泳道中使用的dCTP的浓度（从左到右）：0,50,100,200,400,630,1,200和1,870μM。
计算标准延伸效率
1. 根据Mendelman等人（1990）进行速度测量。将每个引物延伸一个核苷酸的速度（根据以下公式计算：，其中是扩展频带的强度，是引物条带的强度，t是延伸的时间。
2. 然后将（引物每分钟延伸的百分比）对[S]作图，其中[S]是反应中使用的底物（dCTP）的浓度（图3）。
  注意：这些曲线是Michaelis-Menten动力学曲线的典型曲线。
3. 通过曲线拟合获得V max和K m的值。使用Sigmaplot软件将数据拟合到"单矩形2-参数双曲线方程"。
4. 在曲线拟合之后获得的常数"a"对应于V sub max，并且"b"对应于该延伸的K sub。对匹配和错配引物延伸反应分别测定V max和K m值。
5. 标准扩展效率被计算为。
  
  图3.错配引物延伸测定的代表图。在此使用的引物：模板杂交体在3'末端具有C.A错配。通过将点拟合为"单一"来确定Vmax和Km 矩形2参数双曲线方程"使用Sigmaplot软件。

食谱

延伸反应缓冲液（50ml）

1 M Tris HCl（pH 8）
25 ml

3 M KCl
13.3毫升

1 M DTT
1 ml

无RNase水
10.7 ml
2x加载染料（10ml）

50mM Tris HCl（pH6.8）
500微升

100 mM DTT
1 ml

2％SDS
2 ml

0.05％溴酚蓝色
500微升

10％甘油 1 ml

无RNase水
5 ml

参考文献

Achuthan，V.，Keith，B.J.，Connolly，B.A。和DeStefano，J.J。（2014）。人体免疫缺陷病毒逆转录酶在vitr中在生理性镁条件下显示出更高的保真度 > 。 J Virol 88（15）：8514-8527。
Hou，E.W.，Prasad，R.，Beard，W.A。和Wilson，S.H。（2004）。未标记和组氨酸标记的HIV-1反向的高水平表达和纯化蛋白质表达纯化 34（1）：75-86。
Mendelman，L.V.，Petruska，J。和Goodman，M.F。（1990）。基本错配扩展动力学。 DNA polymerase alpha和reverse transcriptase的比较。"生物化学杂志"265（4）：2338-2346。
Menendez-Arias，L。（2009）。逆转录病毒逆转录酶的突变率和内在保真度病毒 1（3）：1137-1165。
Rezende，L.F.and Prasad，V.R。（2004）。 HIV-1逆转录酶中的核苷类似物抗性突变及其对聚合酶保真度和病毒突变率的影响。 Int J Biochem Cell Biol 36（9）：1716-1734。
Svarovskaia，E.S.，Cheslock，S.R.，Zhang，W.H.，Hu，W.S.and Pathak，V.K。（2003）。逆转录病毒突变率和逆转录酶忠诚度。 Front Biosci 8：d117-134。