材料和试剂

来自温室栽培果实的葡萄树浆果。赤霞珠在各种发育阶段（例如豌豆大小，绿色浆果，veraison或后期阶段）。如Mullins和Rajasekaran（1981）中所述制备果实切割物（即每个植物仅具有单个簇的一个主轴线），并在自然光照和半受控温室中生长（平均季节温度幅度为20-35°C），每两周进行杀真菌剂处理（图1）注意：有效的杀真菌剂处理是最大限度地排除病原体感染到葡萄浆果和最小化体外培养的灭菌步骤所必需的。例如，我们在温室中连续提供硫扩散热箱（Nivola Sulfur fl 220 v 3m，图1B）中包含的硫，并且每两周以5g/L用armicarb处理葡萄树。

图1.在半控制温室（A）和硫扩散热箱（B）中生长的水果切割
70％乙醇
NaClO，有效氯2％（Sigma-Aldrich，目录号：425044-1L）
MS（Murashige& Skoog）培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M 0221）
蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
N-Z-胺A（Sigma-Aldrich，目录号：C7290）
维生素
肌醇100mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：I5125）烟酸1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：N0765）
泛酸1mg/L（Duchefa Biochemie，目录号：C0604）
生物素0.01mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）盐酸吡哆醇1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
盐酸硫胺1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
NaClO，有效氯2％（Sigma-Aldrich，目录号：425044-1L）
MS（Murashige& Skoog）培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M 0221）
蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
N-Z-胺A（Sigma-Aldrich，目录号：C7290）
维生素
肌醇100mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：I5125）烟酸1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：N0765）
泛酸1mg/L（Duchefa Biochemie，目录号：C0604）
生物素0.01mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）盐酸吡哆醇1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
盐酸硫胺1mg/L（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
...
20 mM EDTA (see Recipes)

Equipment

Laminar flow cabinet (Steril-Helios, Figure 2A)
Shaker (Dragon lab, sk-330-pro, Figure 2A)
Autoclave machine
Growth room with constant temperature of 26 ± 0.5 °C, light period 16 h/8 h day/night, and light ~50 μmol m^-2 s^-1 (Figure 4H)
Sterilized 6-well plates (Dutscher, catalog number: 353046, Figure 5B)
Sterilized plastic boxes with filter (Dutscher, catalog number: E 1650, Figures 3F, 4G, and 5A)
Tip plate (Figure 3A)
Polystyrene (Figure 3C)
Culture dish (145/20 mm, Greiner Bio-One GmbH, Figure 4E)
Sterilization solution container (Figure 2C-D)
滤嘴，钳子，剪刀和刀片（图2B）

图2.用于葡萄浆果培养的设备 A.具有振动器的层流柜。 B.漏勺，镊子，剪刀和刀片。 C.溶液容器，培养箱和刚刚高压灭菌后的小材料。 D.用于乙醇和NaClO的灭菌容器

程序

液体介质的浮子的制备
1. 收集端板并将其切成适合培养箱的尺寸（图3A和B）
2. 准备对应于尖端板尺寸的聚苯乙烯长方体（图3C）
3. 将聚苯乙烯长方体放在端板的两侧形成浮子（图3D-F）
4. 用10％NaClO和90％乙醇灭菌漂浮物，每次20分钟然后用无菌水冲洗三次，然后将其安装在组织培养箱含有液体培养基。
  
  图3.准备的液体介质的浮子。 A.盒的微量移液器吸头。 B.切割尖端板到用于培养箱的合适尺寸。准备两个聚苯乙烯立方体。 D.用尖头板装配聚苯乙烯长方体形成浮动。浮游物的垂直的看法在文化里面的框。浮子的侧视图里面一个文化箱子。
Berry体外培养
1. 选择带有水果的插条，并在取出所有叶子后送到培养室（图4A）
2. 从母本切下葡萄簇，并且浆果随后从具有浆果花梗（约3mm）的花梗上切除立即滴入自来水（图4B）。
3. 保持自来水运行15分钟以清洁浆果。
4. 将浆果放入70％乙醇中2秒，立即转入 NaClO与2％有效氯与无菌漏勺（图 4D）。
  注意：浆果和灭菌溶液之间的体积比对于有效的灭菌是重要的，并且最小比例为1:3 （浆果/溶液）。
5. 用振荡器以350-450rpm摇动容器NaClO 2分钟（图4C）注意：取决于温室种植的浆果的状态，这步骤可以延长3-5分钟。更长的灭菌会伤害浆果皮肤。
6. 将浆果转移到带有漏斗的灭菌去离子水中（图4D），并以350-450rpm摇动2分钟。
7. 重复步骤B6三次。
8. 将完全漂洗的浆液转移到20mM EDTA溶液中，其包含在大培养皿中（图4E）
9. 在EDTA溶液下再次将浆果花梗切成约2mm 4E），以排除空穴并防止筛子堵塞管由胼lose质合酶，一种严格的钙依赖性酶
10. 轻轻打开培养箱，迅速将浆果放在固体上或液体培养基与浆果花生根培养基（参见食谱，图4F和图5）
11. 轻轻把盖子培养箱（图4G），并将所有箱运输到培养室恒温26±0.5℃，光照16小时/8小时昼/夜，和光〜50μmolm -2 -2 -1 （图4H）。
  
  图4.浆果体外培养程序。A.将带有水果的切片带到实验室后去除所有叶子。 B.从葡萄簇中取出浆果并将其丢弃立即进入自来水。 C.用乙醇和漂白剂消毒浆果解决方案。 D.将消毒的浆果转化为水用于冲洗。 E.在20mM EDTA中的浆果花梗。 F.安装浆果进入培养基。 G.把组织培养箱的盖子。 H.安装组织培养箱进入培养室
12. 可以选择取决于所需实验的替代培养方法（图5）。
13. 浆果培养可以保持长达3个月。自从中等体积比浆果大得多，没有必要改变培养基。然而，改变介质将是非常容易的注射器注射液体介质的组成注意：浆果不是非常紧密地固定在培养基上，所以任何运动和运输应该轻轻地做，以避免浆果倾斜。
  
  图5。不同类型的浆果在体外培养。 A.用液体培养基培养和浮动。 B.在6孔板中用固体培养基培养。 C.文化与液体介质和浮子在一个小容器。

食谱

MS培养基与蔗糖和维生素 4.3 g M0221
20克蔗糖 0.25克N-Z-胺A/B 用涡流
溶解在800ml去离子水中 5毫升维生素200x（见下文）
用0.5 M NaOH将pH调节至5.8 用去离子水完成至1 L / 加入9克固体培养基的琼脂
高压灭菌（120°C，20分钟）
对于含有琼脂的培养基，将4ml培养基倒入6孔板的每个孔中（图5B）;或50ml培养基与具有允许气体交换的特殊过滤器（图4G）一起，在培养基凝结之前和层流室内部。对于液体培养基，用特殊过滤器倒入150ml培养基的组织培养箱（图5A）注意：需要至少2％的蔗糖来防止对于绿色赤霞珠浆果的浆果裂解。不同的品种可能有不同的敏感性，因此必须为其他品种建立合适的蔗糖浓度。
200x维生素
用1滴KOH将8mg生物素溶解在1ml去离子水中 25μl生物素溶液
2 g肌醇-6 20mg烟酸
20毫克泛酸
20mg吡哆辛HCl
20mg盐酸硫胺素用去离子水溶解并加至100ml 储存于-20°C
20 mM EDTA
将7.44g EDTA溶解在1L去离子水中
高压灭菌（120℃，20分钟）
在室温下贮存

致谢

这项工作得到了来自法国国家农业研究所（INRA）环境和农学司（EA）的具体拨款的支持。该协议是基于我们以前的论文（Dai等人，2014）开发的。

参考文献

Bravdo，B.，Shoseyov，O.，Ikan，R。和Altman，A。（1990）。单独的葡萄浆果中的单萜糖苷生物合成在体外培养。 Physiol Plant 78（1）：93-99。
Conde，C.，Silva，P.，Fontes，N.，Dias，A.C.P.，Tavares，R.M.，Sousa，M.J.，Agasse，A.，Delrot，S.andGerós，整个葡萄浆果的生化变化，水果和葡萄酒的质量。 /em> 1，1-22。
Dai，Z.W.，Meddar，M.，Renaud，C.，Merlin，I.，Hilbert，G.，Delrot，S.and Gomes，E。（2014）。长期的体外培养葡萄浆果的培养及其应用评估糖供应对花色素苷积累的影响。 J Exp Bot 65（16）：4665-4677。
Gambetta，G.A.，Matthews，M.A.，Shaghasi，T.H.，McElrone，A.J.and Castellarin，S.D。（2010）。糖和脱落酸信号直向同源物在葡萄成熟开始时被激活。 em> Planta 232（1）：219-234。
Mullins，M.G。，和Rajasekaran，K。（1981）。水果切片：生产葡萄品种试验植物的修订方法。 Am J Enol Vitic ，32：35-40。
Pérez，F.J.，Meza，P.，Berti，M。和Pinto，M。（2000）。碳源和蔗糖浓度对体外培养的葡萄果实的生长和己糖积累的影响植物细胞组织 61（1）：37-40。