图1. MCF7细胞用250μM棕榈酸盐或载体对照处理24小时。一些乳腺癌细胞具有脂肪代谢表型，使得它们对添加生理浓度的外源饱和脂肪酸（例如棕榈酸盐）特别敏感。虽然棕榈酸补充诱导HER2/neu阳性细胞中的细胞死亡，但其它乳腺癌亚型（包括MCF-7细胞）积聚了导致细胞内甘油三酯脂肪储存显着增加的脂肪酸。将细胞固定并用BODIPY 493/503（绿色）对脂肪储存进行染色。 Hoechst 33342（蓝色）用于细胞核染色。

材料和试剂

适合测试的细胞系MCF7（ATCC，目录号：HTB-22 ^TM）作为染色对照表现良好
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（具有L-谷氨酰胺的高葡萄糖）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH3024301）或适用于MCF7细胞培养物的其它培养基
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如HyClone，目录号：SH30258-02）或Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（具有Ca 2+和Mg 2+）（DPBS）（例如Sigma-Aldrich，目录号：D1283）。
棕榈酸钠（用作阳性对照）（Sigma-Aldrich，目录号：P9767）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-Bora-3a，4a-Diaza-s-Indacene）（Life Technologies，目录号：D-3922） />
37％甲醛（Thermo Fisher Scientific，目录号：F79）
Hoechst 33342（Life Technologies，目录号：H21492）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如HyClone，目录号：SH30258-02）或Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（具有Ca 2+和Mg 2+）（DPBS）（例如Sigma-Aldrich，目录号：D1283）。
棕榈酸钠（用作阳性对照）（Sigma-Aldrich，目录号：P9767）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-Bora-3a，4a-Diaza-s-Indacene）（Life Technologies，目录号：D-3922） />
37％甲醛（Thermo Fisher Scientific，目录号：F79）
Hoechst 33342（Life Technologies，目录号：H21492）... Fluorescence microscope or automated imaging system (e.g. IN Cell Analyzer, GE Healthcare)

Procedure

Plate 10,000-20,000 cells per well in 100 μl DMEM high glucose with L-glutamine, 10% FBS, in the 96-well plate. Doing a serial dilution can be helpful to determine the effect of cell number on BODIPY intensity.
Incubate the cells at 37 °C overnight.
Dilute the sodium palmitate stock solution in pre warmed DMEM high glucose with L-glutamine, 10% FBS. A range of 50-500 μM is useful to demonstrate BODIPY-based lipid content relative quantification. Prepare appropriate vehicle controls.
Carefully aspirate medium from the 96-well plate and replace with treatment medium (use 100 μl per well).
Incubate the cells at 37 °C overnight.
Prepare a 5% formaldehyde solution in PBS. Add 100 μl per well directly into the tissue culture medium to achieve a final formaldehyde concentration of 2.5%.
Incubate for 15 min at room temperature.
Prepare the staining solution; dilute the BODIPY and Hoechst stock solutions in PBS to a working concentration of 10 μg/ml BODIPY and 1 μg/ml Hoechst. Calculate 100 μl per well. Both dyes can be added in parallel, there is no need for sequential staining.
Carefully remove the formaldehyde from the cells and wash twice with 100 μl of PBS per well.
Add 100 μl staining solution per well.
Incubate for 30 min at room temperature, in the dark.
Wash twice with 100 μl of PBS per well.
Remove PBS, add 130 μl of PBS per well (only required for IN Cell Analyzer).
BODIPY and nuclei Hoechst fluorescence are imaged and quantified using fluorescence microscopy with appropriate filter sets. Our laboratory makes extensive use of the INCell Analyzer 2200 and INCell Investigator software for these measurements. Fluorescence intensity per cell is proportional to the neutral lipid content in the cell.

Notes

在使用前立即溶解棕榈酸钠在75mM的DMSO中，不储存
如果在用常规PBS洗涤期间许多细胞从培养板丢失，使用DPBS洗涤并制备BODIPY和Hoechst的工作溶液。
当比较不同的细胞或培养条件时，应当注意大致相等的细胞密度染色

食谱

500x BODIPY 493/503储备液
将BODIPY 493/503在DMSO中以5mg/ml溶解等分并在-20℃下在黑暗中保存
10,000x Hoechst 33342储备溶液
使溶解在DMSO中的Hoechst 33342 10mg/ml，
等分并在-20℃下在黑暗中保存

致谢

由美国陆军医学研究获得活动W8IWXH-04-1-0474和NCI 1R01CA136658支持到DSC。

参考文献

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