材料和试剂

c-fms-EGFP小鼠，其角膜受到1天前的化学损伤伤害（Chan和Werb，2015）
Avertin（Sigma-Aldrich，目录号：T4，840-2）
15.5ml叔戊醇（2-甲基-2-丁醇）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A730-1）
盐水0.9％
GenTeal凝胶（0.3％，眼睛凝胶）（Novartis，NDC：0078-0429-47）
Avertin储备溶液（见配方）
Avertin工作液（1.2％）（见配方）

设备

25计量针
5 ml和50 ml注射器
1.5 ml微量离心管
0.22微米过滤器
头戴式适配器（Narishige，目录号：SG-4N）
Dumont no。 5镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-10）
UST-2实体万向节（Narishige，目录号：UST-2）
聚乙烯管（0.28mm i.d.，0.61mm o.d.）（Warner Instruments，目录号：64-0750）
加热垫
装备有GFP滤光器，氩激光器，40x物镜（NIR/0.8NAW透镜）和照相机（Nikon D-eclipse C1Si）（图1）的尼康光谱共聚焦（C1Si）

图1.共焦点设置。成像设置包括共焦显微镜，相机，氩激光和计算机。

软件

尼康共焦软件（尼康，Ez-C1黄金版本3.8）
Imaris软件（Bitplane，适用于Windows X64的7.3.1版）

程序

伦理声明：此处讨论的所有程序均符合加利福尼亚大学旧金山机构动物护理和使用委员会的批准。

设置共聚焦显微镜。
1. 打开氩气激光器。
2. 开放成像软件Ez-C1 Gold Ver。 3.8。
设置头部保持适配器（图2）。

图2.头枕适配器设置。使用鼻梁和耳杆将鼻子和耳朵固定到位，从而使鼠标头稳定。
设置眼稳定器（图3）。
1. 附上号码。 5 Dumont镊子到UST-2实体万向节。
2. 切割18毫米聚乙烯管。聚乙烯管用于隔离和稳定整个眼睛。覆盖的提示镊子与管，创建一个环之间的尖端。
图3.眼睛稳定器设置。通过环绕眼睛周围的管道并紧固眼睛，可以稳定鼠标眼睛。
将加热垫放置在物镜下。加热垫用于在手术过程中将体温维持在37℃
麻醉小鼠通过注射1.2％的Avertin溶液使用剂量为0.2毫升/10克体重腹膜内用25号针。尽可能减少呼吸运动至关重要，因此麻醉鼠标，直到呼吸非常浅且不迅速。
小鼠完全麻醉后，将鼠标的头部放在头部保持适配器（图4）。

图4.将鼠标放置在头戴式适配器中。使用鼻梁和耳杆将鼠标头固定到位。
将头部支架与鼠标一起放在40x显微镜物镜下的加热垫上。使头部倾斜，使得选择用于成像的角膜朝向透镜物镜朝上（图5）。

图5.鼠标头在头枕适配器中的旋转。当使用眶周压力推动眼睛时，旋转鼠标头，使中心角膜朝向天花板。通过手动倾斜头部保持适配器来实现头部到一个角度的旋转
应用温和的眶周压力支撑眼睛（图5）。轻轻地将眼稳定器的聚乙烯管环放在角膜巩膜连接处以下（图6，图8）。小心不要在握住鼠标时中断呼吸或血液循环。调整镊子以收紧环圈，以便稳定眼睛并保持眼睛健康。

图6.眼睛的稳定。聚乙烯管环绕在巩膜连接处下方的眼睛上，钳子被拧紧，以保持管子就位。最终定位鼠标，头部适配器和万向节用镊子
轻轻挤压GenTeal凝胶管，将少量GenTeal凝胶直接从管中放置到角膜上，足以用作物镜和角膜之间的浸液（图7）。

图7. GenTeal凝胶的应用。挤压Genteal凝胶管，将软膏直接涂抹在眼睛的整个表面。一列Genteal Gel从小鼠角膜延伸到显微镜物镜
使用明场观察聚焦在中心角膜（图8）。

图8.中心角膜。透明角膜使用明场照明进行对焦，虹膜组织和圆形瞳孔也是如此。角膜巩膜连接点由箭头指示。
关闭明场灯并打开落射荧光灯。使用GFP滤镜找到成像的最佳角膜面积和深度。尝试尽可能接近中心角膜，因为它比旁中心角膜更平坦，允许更多的细胞在同一平面内的焦点。
将显微镜设置从落射荧光切换到共焦。选择具有488激发的滤波器立方体。开放成像软件Ez-C1 Gold Ver。 3.8。并使用以下采集设置。以下设置优化骨髓细胞的分辨率，同时限制光漂白的量。
1. 针孔：大（如果有足够的信号，可以使用较小的针孔）
2. 分束器：408/488/581或488/561/638
3. 激发强度：对于488 =高达10％
4. 每行维数：512 x 512
5. 增益：180-190（可根据需要调整）
6. 像素驻留：在6和8之间
7. Timelapse - 尽快
使用共焦成像软件执行单次扫描以优化成像设置（图9）。应用所需的最小激光功率和扫描时间，以避免光损伤和漂白。
使用timelapse获取连续捕获图像大约每3.22秒为20-90分钟。
从眼稳定器和头戴式适配器中取出鼠标。
安乐死鼠标。
数据分析是一个非常复杂的问题，在此不能完整涵盖。执行的数据分析类型取决于所提出的研究问题。最近的一项审查强调了可以进行的各种分析（Weigert等人，2013）。一些软件和免费软件程序可用于图像分析，包括Bitplane Imaris，ImageJ和CellTrack。图10示出了使用Bitplane Imaris软件程序对单个骨髓细胞的示例性轨迹分析。详细的Imaris软件说明可通过公司网站（ http://www.bitplane.com/imaris ）获取。。在时间推移成像过程中可能发生由样品焦点的缓慢变化所表现的轴向波动。 Imaris软件程序可以通过其漂移校正功能帮助校正这些波动。

图9.共聚焦显微镜。未损伤和受伤角膜基质中骨髓细胞（绿色）的典型图像。

图10.图像分析。使用Bitplane Imaris软件程序在90分钟内对单个骨髓细胞的样品活动性分析。

食谱

Avertin储液
在暗室中将25g Avertin（2,2,2-三溴乙醇）与15.5ml叔戊醇（2-甲基-2-丁醇）在室温下混合12小时。
制备0.5ml原料
储存在-20°C的黑暗中
Avertin工作溶液（1.2％）
在20℃预热0.9％盐水
将0.5ml Avertin原液与39.5ml预热的0.9％盐水混合
在密闭的黑色或箔包装容器中混合
通过0.22微米过滤器将溶液过滤到黑色或箔覆盖的容器中
储存在4°C
工作解决方案在1周后到期

致谢

该协议改编自Speier等人（2008）。这项工作得到国立卫生研究院（K08 EY018858和R01 EY002162到M.F.C.和R01 CA057621和P01 AI053194到Z.W.）的赠款支持。

参考文献

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