材料和试剂

拟南芥 14天的幼苗
M13F：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'和M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
TRNzol试剂（TIANGEN ^®，目录号：DP40502）
Dynabeads mRNA纯化试剂盒（Life Technologies，目录号：61006）
FirstChoice ^® RLM-RACE Kit（Life Technologies，目录号：AM1700）
RNA 5'多磷酸酶（Epicentre，目录号：RP8092H）
T4 RNA连接酶1（New England Biolabs，目录号：M0204S）
T4 RNA连接酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0216L）
腺苷5'-三磷酸（New England Biolabs，目录号：P0756S）
RNasin Plus RNA酶抑制剂（Promega Corporation，目录号：N2615）
糖原（RNA级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0551）
TransScript II第一链cDNA合成SuperMix（TransGen Biotech，目录号：AH301）
TaKaRa ExTaq DNA聚合酶（Takara Bio Company，目录号：RR001B）
pEASY -T1克隆试剂盒（TransGen Biotech，目录号：CT10102）
Plus II DNA标记（TransGen Biotech，目录号：BM121-01）。
焦碳酸二乙酯/DEPC（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
TIANgel Midi Purification Kit（TransGen Biotech，目录号：DP209）
UltraPure ^TM琼脂糖（Life Technologies，目录号：75510019）
DEPC处理的去离子水（见配方）
3 M乙酸钠（见配方）
70％，100％乙醇（见配方）
50x TAE缓冲液（见配方）

设备

MaxyClear Microtubes（1.5ml）（Corning Incorporated，Axygen ，目录号：MCT150C）
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-1000）
Thermomixer comfort（Eppendorf，目录号：5362.000.019）
Eppendorf离心机（Eppendorf，目录号：5417R）
PCR系统（Eastwin Life Science，目录号：EDC-810）
其他标准实验室设备

程序

底漆设计
1. 一般来说，引物应该对靶标具有高度特异性序列，能够与其靶序列形成稳定的双链体，和没有二级结构
2. 三个引物约20〜25 长度的核苷酸应当被合成。这些的GC含量引物设计为尽可能相似。
  注意：我们建议 GC比例在40％〜55％之间。例如，中列出的引物的GC比率图2A在该范围内。但是，此参数不是固定的，它取决于你的基因。
3. 第一个基因特异性引物cRT（图 1）应当位于已知区域中并用于反向转录（RT）。
  注意：cRT是基因的反向。其定位推荐在预期的100〜200 nt内 5'末端。例如18c位于距预期5'末端204nt内的成熟18S rRNA（图2A）。
4. 其他两个引物，cF1和 cR1，分别位于cRT引物的5'和3'侧（图1），用于初级PCR扩增5'和3' 目标转录物的末端。 cF1和cR1与序列退火分别位于cRT的3'和5'（相对于cDNA非RNA）。他们的本地化推荐距离预期约100 nt 5'和3'末端注意：引物cF2或cR2，紧接着在cF1或cR1引物的下游 1），进一步嵌套PCR以提高PCR特异性。用于嵌套PCR的引物cF2和cR2可以在已知区域设计成熟RNA或预测区域仅存在于前体RNA中。相比 cF1/cR1，这三种引物组合（cF1/cR2，cF2/cR1和 cF2/cR2）可用于嵌套PCR。
图1.循环RT-PCR（cRT-PCR）的图示。总RNA或聚腺苷酸化RNA用T4 RNA连接酶环化，并用基因特异性引物cRT反转录。然后扩增5'和3'末端并测序。 A和D标记特定RNA的已知5'和3'末端。蓝框从A到B和黑框从C到D分别表示PCR引物cF1和cR1的位点。 B和C之间的白色框表示cRT引物的基因座。与两个主要引物cF1和cR1相邻的引物cF2和cR2分别设计用于嵌套PCR。
RNA提取（线性RNA）
1. 紧接着在cF1或cR1引物的下游 1），进一步嵌套PCR以提高PCR特异性。用于嵌套PCR的引物cF2和cR2可以在已知区域设计成熟RNA或预测区域仅存在于前体RNA中。相比 cF1/cR1，这三种引物组合（cF1/cR2，cF2/cR1和 cF2/cR2）可用于嵌套PCR。
图1.循环RT-PCR（cRT-PCR）的图示。总RNA或聚腺苷酸化RNA用T4 RNA连接酶环化，并用基因特异性引物cRT反转录。然后扩增5'和3'末端并测序。 A和D标记特定RNA的已知5'和3'末端。蓝框从A到B和黑框从C到D分别表示PCR引物cF1和cR1的位点。 B和C之间的白色框表示cRT引物的基因座。与两个主要引物cF1和cR1相邻的引物cF2和cR2分别设计用于嵌套PCR。
RNA提取（线性RNA）
1. ...
RNA ligation (Circular RNA, cRNA)
1. 10 μg of total RNA or 0.5 μg of poly(A) RNA was used for each ligation reaction (50 μl). RNA is pre-incubated in Thermomixer comfort at 70 °C for 5 min, and then immediately chilled on ice for 2 min.
  Note: RNA decapping step is recommended before RNA ligation when analyzing nucleus-encoded mRNAs (Slomovic et al., 2008), since RNAs with 5’-cap structure will inhibit the RNA ligation efficiency. Although this step was not applied in our previous work (Hang et al., 2014), we recommend performing this assay if necessary with these two kits according to their corresponding protocols. RNA 5´ Polyphosphatase from Epicentre
  (http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/rna-5-polyphosphatase.pdf?sfvrsn=12) or Tobacco Acid Pyrophosphatase supported in FirstChoice^® RLM-RACE Kit (https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_056070.pdf).
2. Prepare the following reaction system:
  RNA 10 μg total/0.5 μg poly(A)
  T4 RNA Ligase 1 (10,000 U/ml) 3 μl (30 U)
  10x T4 RNA Ligase 1 buffer5 μl
  Adenosine-5'-Triphosphate (10 mM ATP) 5 μl (1 mM)
  RNase inhibitor (40 U/μl) 1 μl (40 U)
  DEPC-treated deionized waterto 50 μl
  Note: The ligation reaction system may be optimized in the dosage of T4 RNA ligase 1 or ATP. Be aware that the appropriate concentration of ATP should be added if it is not supplied in the T4 RNA ligase buffer. The appropriate concentration of ATP should be in accordance with the product information of the commercial T4 RNA ligase 1. We used T4 RNA Ligase 1 from New England Biolabs (see in materials and reagents). In its properties and usage section, 1 mM ATP is suggested to add into the reaction system, since there is no ATP in the 10 x T4 RNA ligase 反应缓冲液（ https://www.neb.com/产物/m0204-t4-rna连接酶-1-ssrna连接酶 - tabselect0 ）。此外，参考伴随协议优化RNA环化（ https：//www。 neb.com/protocols/1/01/01/rna-circularization-using-t4-rna-ligase-1 ）。在此协议，20μl反应系统补充20-50μMATP 和10％PEG8000，然后在25℃下孵育1〜2小时在16℃过夜以获得更好的产率。
3. 充分混合并在Thermomixer中37°C温育1〜2小时
4. 在65℃孵育15分钟以失活T4 RNA连接酶1.
5. 乙醇通过加入5μl3M乙酸钠（pH 5.2）沉淀RNA， 2μl糖原（20mg/ml）和171μl100％乙醇。保持混合物在冰上30分钟（短时间）或在-20℃下储存过夜沉淀连接的RNA 注意：-20°C下的沉淀时间更长建议过夜更好的RNA回收。浓度糖原为20mg/ml。其工作浓度约为0.7μg/μl 当将2μl糖原加入50μl反应产物加上5μl3M 乙酸钠。值得注意的是，最终0.05-1μg/μl的浓度根据其产品说明建议糖原。
6. 在4℃下以12,000rpm旋转样品15分钟。
  注意：对于给定rpm的力根据转子而变化。当我们使用 Eppendorf离心机5417R，速度12,000rpm等于15,294×g。
7. 弃去上清液，用500μl70％乙醇洗涤沉淀，然后在4℃以12,000 rpm旋转15分钟。
8. 丢弃上清液并风干沉淀。重悬RNA中 DEPC处理的去离子水，70μl总RNA或7μl聚（A） RNA。 RNA样品可储存于-80℃直至使用注意：我们有没有比较cRNA和正常RNA在-80℃下的半衰期然而，虽然我们预测cRNA是稳定的并且可以保持长时间在-80°C。我们建议进行逆转录尽快。
用基因特异性引物（Circular cDNA，ccDNA）进行逆转录
1. 准备以下反应系统并在0℃预孵育混合物 70℃5分钟，然后在冰上冷却2分钟。 1μg总cRNA或对于每个逆转录使用0.5μg的poly（A）cRNA。
  cRNA 7μl
  RT引物（图1中的cRT）2 pmol
  DEPC处理的去离子水至9μl
2. 轻轻旋转混合物，向每个样品中加入以下反应混合物 2x TS反应混合10μl
  TransScript ^？ II RT/RI Enzyme Mix 1μl
  充分混合，在50℃孵育1小时注意： 2x TS Reaction Mix和TransScript 支持TransScript®II第一链cDNA合成SuperMix。他们没有目录号，因此没有列在材料和试剂部分。
3. 在85℃孵育5分钟以灭活TransScript ^？ II RT酶。
4. 加入180μlDEPC处理的去离子水稀释产物至终体积200μl。
PCR扩增
1. 准备一般反应混合物用于PCR（总共50μl）：
  cDNA5μl
  ExTaq 10x缓冲液5μl
  dNTPs混合物（2.5mM每种dNTP）4μl
  正向引物（cF1，10μM）1μl（10 pmol）
  反向引物（cR1,10μM）1μl（10pmol）
  TaKaRa ExTaq DNA聚合酶（5U /μl）0.12μl（0.6U）
  去离子水33.88μl
2. 根据下述程序运行PCR扩增：
  一个。 94℃3分钟;
  b。 94℃30秒;
  C。 55℃下30秒;
  d。 72℃1分钟; 重复步骤b-d 30个周期
  e。 72℃10分钟;
  F。保持在20°C。
  注意：退火温度和延伸时间可以通过优化案件。我们建议尝试之间的常规退火温度 55〜60℃。我们知道，较高的退火温度可能增加产品特异性。因此，我们可以比较PCR产物 55°C，58°C和60°C选择最好的一个。对于伸长时间，我们宁愿选择1分钟，第一次尝试看看PCR 产品长度（我们假设它不超过1000 bp）。然后，我们会相应地调节伸长时间。总之，伸长时间取决于PCR产物的潜在长度和延伸率 DNA聚合酶。
3. 加载8μl的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上（用溴化乙锭，EtBr），并运行直到溴酚蓝染料 2/3下来的凝胶。图像凝胶，并确定是否这批次的循环RT-PCR成功（锋利和强带）和该候选频带应该被切割用于进一步分析。
  注意：如果它不能很好地工作，PCR系统应该在退火中优化温度，扩增循环，PCR酶等。此外，基于用cF1/cR1的初级PCR，进一步嵌套PCR cF1/cR2，cF2/cR1或cF2/cR2可有助于改善产品特异性，如图1所示。对于嵌套PCR，PCR混合物组件和PCR程序与第一轮PCR相同，除外对于引物组合和DNA模板。
4. 加载所有剩余的PCR产物在新的1％琼脂糖凝胶上。剪切候选条带并用TIANgel Midi Purification Kit纯化凝胶中的DNA
DNA测序和分析
1. 将纯化的DNA产物克隆到pEasy-T载体中。
2. 对于菌落PCR制备主反应混合物，除了DNA模板（总共20μl）：
  ExTaq 10x缓冲液2μl
  dNTPs混合物（2.5mM每种dNTP）1μl
  M13F引物（10μM）0.5μl（5pmol） M13R引物（10μM）0.5μl（5pmol） TaKaRa ExTaq DNA聚合酶（5U /μl）0.12μl（0.6U）
  去离子水15.88μl
  首先制备PCR反应混合物，并等分到0.2ml PCR管中
3. 通过白 - 蓝菌落选择选择阳性克隆。取20μl 移液器吸头和触摸阳性菌落非常轻轻，浸泡的提示a 几次到20微升的PCR混合物
4. 运行PCR 根据E.2中描述的程序进行扩增。伸长率时间取决于PCR产物的长度。对于TaKaRa ExTaq ^® DNA 聚合酶，1kbp PCR产物的延伸时间为1分钟
5. 使用1％琼脂糖凝胶用EtBr染色分析PCR产物。含有用于DNA测序的尖锐目标条带的消除凝胶切片 M13F测序引物。我们建议至少排列15个样本可靠的结果。
  注意：具有M13F和M13R的DNA序列引物是确定5'和3'末端所必需的靶RNA，特别是在3'尾的高聚腺苷酸化RNA。
6. DNA测序数据用基本局部比对搜索工具分析（BLAST）从国家生物技术信息中心（NCBI）。选择有机体： Arabidopsis thaliana 。搜索数据库：参考基因组序列（refseq_genomic）使用Megablast（优化高类似序列）。
图2.用于鉴定atprmt3-2中的前-18S rRNA的循环RT-PCR 。来自Col-0和的14天龄幼苗的总RNA > atprmt3-2 突变体用于cRT-PCR测定。（A）用于该测定中的寡核苷酸。 18c是用于pre-18S rRNA的逆转录的cRT引物。列出它们的长度，GC含量和Tm值。（B-C）用18c反转录后用引物r5/r6（B）和r5/r8（C）扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶分析。通过在1.5％琼脂糖凝胶中的凝胶电泳分析反应产物并用0.5μg/ml溴化乙锭染色。 DNA标记物显示在左边。将标记在右侧的切除候选条带并提取DNA克隆到pEasy-T载体中。（D）用M13F和M13R引物进行菌落PCR 30个循环。用正确的分子量（红色箭头）切割目标条带用于使用M13F测序引物进行DNA测序。避免PCR产物具有异常的分子量（蓝色箭头），这是在凝胶切割步骤中的污染物。（E）该图说明了引物的定位，扩增的PCR片段和DNA测序结果。对于每个片段，从野生型和atprmt3-2样品获得的克隆数目显示在右侧。 5'ETS，外部转录序列。 ITS1，内部转录序列。 P，P1和P'是5'ETS中的已知切割位点。 D，A2和A3是ITS1中的已知切割位点。

食谱

DEPC处理的去离子水将1ml DEPC加入1L去离子水中，混合并在室温下放置过夜
在120℃高压灭菌30分钟
3 M乙酸钠（pH 5.2）
将40.8g乙酸钠溶解在40ml DEPC处理的去离子水中，用乙酸调节至pH 5.2。
加入去离子水至最终体积为100ml
在120℃高压灭菌15分钟
70％，100％乙醇用DEPC处理的去离子水稀释
50x TAE缓冲区
在800ml去离子水中溶解242g Tris碱和37.2g Na 2 EDTA EDTA 2 H 2 O 2，加入57.1ml乙酸，并调节至 pH 8.0用NaOH。
加入去离子水至最终体积为1000ml

致谢

该协议改编自以前发表的研究（Barkan，2011; Slomovic等人，2008）和Alice Barkan博士的实验室主页（ http://pml.uoregon.edu/protocols.html ），并且在（Hang et al。，2014）。这项工作得到中国国家自然科学基金31330020和31210103901（到X.C.），31370770和31171184（C.L.）和31200900（X.D.）和植物基因组学批准SKLPG2011B0101国家重点实验室的支持。

参考文献

Barkan，A。（2011）。研究叶绿体转录物的结构和加工。方法 em> 774：183-197。

Hang，R.，Liu，C.，Ahmad，A.，Zhang，Y.，Lu，F.and Cao，X.（2014）。拟南芥蛋白精氨酸甲基转移酶3是核糖体生物发生所必需的，通过影响前体核糖体RNA processing。 Proc Natl Acad Sci USA 111（45）：16190-16195。

Lykke-Andersen，S.，Brodersen，D.E.and Jensen，T.H。（2009）。真核生物外来体的起源和活性。细胞科学122（Pt 10）：1487-1494。

Slomovic，S.，Portnoy，V。和Schuster，G。（2008）。检测和表征真核生物，细菌，古细菌和细胞器中的聚腺苷酸化RNA。方法Enzymol 447：501-520。