材料和试剂

RPMI 1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：22400-089）
台盼蓝0.4％溶液（Lonza，目录号：17-942E）
骨髓来源的抑制细胞分离试剂盒（小鼠）（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-538）
Pan T Cell Isolation Kit II，小鼠（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-130）
流式细胞术的抗体：Ly-6G-FITC（Gr1，RB6-8C5），CD11b-PE（M1/70）和CD3-FITC（17A2）（Biolegend，目录号分别为108405,01207和100203） />
MACS BSA Stock Solution（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-376）
AutoMACS 冲洗溶液（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-222）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
无菌红细胞裂解缓冲液（RBC裂解缓冲液）（参见配方）
MACS缓冲区（参见配方）

设备

LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
MidiMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）
MACS MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
宽视场显微镜（Nikon Diaphot Phase Contrast Inverted Laboratory Microscope，目录号：805426）
无菌镊子和剪刀
流式细胞仪
1ml注射器（29G）（BD Biosciences，目录号：329410）
无菌细胞过滤器70μm（BD Biosciences，目录号：352350）
15ml锥形管（BD Biosciences，目录号：352095）
桌面centifuge
细胞培养离心机
无菌培养罩
血细胞计数器
60 mm细胞培养皿

程序

脾细胞的分离
1. 准备单个细胞悬浮液从小鼠（支持TRAMP-C2肿瘤，约4个月大）脾脏在无菌培养罩中。中断脾用1ml注射器的柱塞对着70-μm细胞过滤器在装有2ml RPMI1640的60mm培养皿中。
2. 将单细胞悬浮液在15ml锥形管中在300×g离心10分钟，在室温下离心。
3. 用5ml RBC裂解缓冲液重新悬浮脾细胞，孵育5 min。用10ml PBS稀释并在300×g离心10分钟。重悬细胞沉淀在5ml MACS缓冲液（4℃），并计数活细胞数字使用0.4％台盼蓝溶液。每个脾产生约200× 10 6脾细胞。
4. 一个脾可以提供足够的Gr1 ⁺ CD11b ⁺ DP 用于移植3只实验小鼠的细胞; CD3 ⁺细胞从一个脾脏分离也足够移植3 实验小鼠。可以汇集来自2-3个单独脾脏的脾细胞免疫细胞纯化前。
使用Miltenyi髓样衍生的抑制细胞分离试剂盒（小鼠，用于细胞的阳性分离的试剂盒）从脾细胞中纯化CD11b + CD11b + +/- DP1 +细胞。
1. 在4℃下在15ml锥形管中以300×g离心细胞悬浮液10分钟。完全吸出上清液
2. 重悬细胞沉淀在350微升MACS缓冲区每10 <支柱> 8 总细胞
3. 每10 ^8个总细胞加入50μlFcR封闭试剂。
4. 充分混合并在冰箱（2-8℃）中孵育10分钟
5. 加入100μl的抗Ly-6G-生物素（MDSC-Kit）
6. 充分混合并在冰箱（2-8℃）中孵育10分钟
7. 通过每10 8个细胞加入10 ml MACS缓冲液洗涤细胞并离心在300×g下在4℃温育10分钟。完全吸出上清液
8. 在800μlMACS缓冲液中重悬最多10个⁸细胞
9. 加入200μl抗生物素MicroBeads。
10. 充分混合并在冰箱（2-8℃）中孵育15分钟
11. 通过每10 8个细胞加入10ml的MACS缓冲液洗涤细胞并离心在300×g下在4℃温育10分钟。完全吸出上清液
12. 在500μlMACS缓冲液中重悬最多10个⁸细胞
13. 将LS柱置于MidiMACS分离器的磁场中。
14. 通过用3ml MACS缓冲液冲洗平衡柱
15. 将细胞悬浮液应用到柱上; 收集含有未标记细胞的流过物
16. 用3×3ml MACS缓冲液洗涤柱子，收集未标记的细胞，其通过并与来自步骤B15的流出物合并; 保持未标记的细胞在冰上，直到进一步处理
17. 从分离器中取出色谱柱，并将其放入15 ml锥形管中
18. 移取5 ml MACS缓冲液至柱上; 立即冲出来通过将柱塞牢固地推入柱中而被磁性标记的细胞并收集CD11b ⁺ Gr1 ⁺ DP细胞
19. 使用计数活细胞数 0.4％台盼蓝溶液。放置2×10 5个细胞用于评价净化效率如下所述。
使用Pan T细胞分离试剂盒II（小鼠，用于细胞阴性分离的试剂盒）从脾细胞中纯化Miltenyi T细胞
1. 计数和离心来自步骤B15-16的未标记的细胞悬浮液; 重悬细胞沉淀在400μlMACS缓冲液每10 ^8总细胞
2. 每10个 8个细胞加入100μl生物素 - 抗体混合物。
3. 充分混合，并在冰箱（2-8℃）中孵育5分钟
4. 每10个 8个总细胞加入300μlMACS缓冲液。
5. 每10 ^{8个细胞添加20微升抗生物素微珠。}
6. 充分混合并在冰箱（2-8℃）中孵育10分钟
7. 将LS柱放在MidiMACS分离器的磁场中。
8. 通过用3ml MACS缓冲液冲洗来制备柱
9. 将细胞悬液应用到柱上，收集含有未标记细胞的流通液，代表富集的T细胞
10. 用3 ml MACS缓冲液洗涤柱子，收集未标记的细胞通过，代表富集的T细胞; 结合步骤C9的流出物
11. 计数活细胞数使用0.4％台盼蓝溶液。放置2×10 5个细胞用于评价净化效率如下所述。
通过流式细胞术来控制纯化效率
1. 用20μl悬浮液染色2×10 5个总细胞（步骤B19）含有预滴定量的抗小鼠Ly-6G和抗小鼠CD11b。将抗体在含有1％BSA的PBS中1:100稀释
2. 染色2×10 5个总细胞（步骤C11），其中20μl的悬浮液含有预滴定量的抗小鼠CD3。
3. 在4℃孵育30分钟，并在150μl洗涤缓冲液（含1％BSA的PBS）中洗涤
4. 在4℃和500×g离心细胞悬浮液5分钟。弃去上清液并保留细胞沉淀。
5. 重悬在200μl洗涤缓冲液（含1％BSA的PBS）中，并在流式细胞仪中分析。
图1. CD11b +细胞（Gr1和CD11b抗体）和CD3 sup + T细胞（CD4和CD4）的纯度， CD3抗体）可通过FACS分析
评估
小鼠前列腺癌模型和尾静脉注射（≥5只小鼠/组）
1. 具有C57/B16背景的小鼠皮下（s.c.）注射 TRAMP-C2细胞（每只小鼠在0.2ml PBS中的3×10 6个细胞）的免疫细胞的过继转移（Yan等人，2014）。在第7天和第14天注射后，另外两个剂量的纯化的（每只小鼠5×10 6个细胞）或纯化的CD3 +淋巴细胞的培养物上清液中培养CD11b + （每只小鼠5×10 6个细胞）需要通过过继转移静脉注射。小鼠出现时将被牺牲濒死（45天）。
2. 在灯下预热小鼠5分钟实现尾静脉注射的血管舒张。注射纯化的CD11b +细胞（每只小鼠5×10 6个细胞/200μlPBS）或纯化的CD3 +细胞，/sup> T细胞（5×10 6个细胞/200μlPBS /小鼠）的尾静脉中 ml注射器用29 G针
3. 将密切监测肿瘤发展，并且每7天测量肿瘤大小。
图2.来自肿瘤攻击的WT小鼠的DP，但不是T细胞足以允许用TRAMP0C2细胞注射的ogr1 -/-/-/- 小鼠中的肿瘤生长。 strong>（Yan 等人，2014）

食谱

RBC裂解缓冲液
0.15 M NH 4 Cl
1mM NaHCO 3/v/v 0.1mM EDTA溶于无菌双蒸水中用1M HCl将pH调节至7.2-7.4 过滤灭菌
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
136 mM NaCl 8.2mM Na 2 HPO 4
1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v 2.7mM KCl（pH7.4）
MACS缓冲区
通过用autoMACS稀释MACS原液1:20制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2），0.5％牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的溶液。 ®冲洗溶液。
保持缓冲液冷（2-8°C）。
使用前脱气缓冲液，因为气泡可能堵塞色谱柱

致谢

这项工作部分得到国家卫生研究院（RO1155145至YX）的支持; 和YX的Mary Fendrich-Hulman慈善信托基金。

参考文献

Foster，B.A.，Gingrich，J.R.，Kwon，E.D.，Madias，C.and Greenberg，N.M。（1997）。源自小鼠前列腺（TRAMP）转基因腺癌的前列腺上皮细胞系的表征。 Cancer Res 57（16）：3325-3330。
Yan，L.，Singh，L. S.，Zhang，L.and Xu，Y.（2014）。 OGR1在前列腺癌的髓系细胞中的作用癌基因 33（2）：157-164。