材料和试剂

小鼠
可以使用任何供体小鼠，只要供体和受体具有相同的背景菌株（即BALB/C进入BALB/c或B1/6进入B1/6）以防止排斥问题。我们选择具有对我们的感兴趣的抗原NP特异的B细胞频率增加的转基因供体小鼠。这样我们可以确定对我们的抗原特异的B细胞的数目，并且这些将容易通过流式细胞术和elispot鉴定。然而，野生型小鼠也将对NP响应，只是以较低的频率
1. B1.8 ^+/-Jκ^+/- BALB/c小鼠
  注意：B1.8KI BALB/c小鼠（Sonoda等人，1997）产生并保持在JκKO上菌株（Chen等，1993）以富集λ⁺ NP-特异性B的频率细胞。将B1-8KI +/+ JκKO /- 小鼠与BALB/c小鼠 Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）产生B1.8 +/- Jκ^+/- BALB/c 小鼠，其用于初始对照和NP ^{+ 的转移细胞用于产生MBC。
  材料和试剂
  小鼠
  可以使用任何供体小鼠，只要供体和受体具有相同的背景菌株（即BALB/C进入BALB/c或B1/6进入B1/6）以防止排斥问题。我们选择具有对我们的感兴趣的抗原NP特异的B细胞频率增加的转基因供体小鼠。这样我们可以确定对我们的抗原特异的B细胞的数目，并且这些将容易通过流式细胞术和elispot鉴定。然而，野生型小鼠也将对NP响应，只是以较低的频率 B1.8 ^+/-Jκ^+/- BALB/c小鼠
  注意：B1.8KI BALB/c小鼠（Sonoda等人，1997）产生并保持在JκKO上菌株（Chen等，1993）以富集λ⁺ NP-特异性B的频率细胞。将B1-8KI +/+ JκKO /- 小鼠与BALB/c小鼠 Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）产生B1.8 +/- Jκ^+/- BALB/c 小鼠，其用于初始对照和NP ^{+ 的转移细胞用于产生MBC。
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  小鼠
  可以使用任何供体小鼠，只要供体和受体具有相同的背景菌株（即BALB/C进入BALB/c或B1/6进入B1/6）以防止排斥问题。我们选择具有对我们的感兴趣的抗原NP特异的B细胞频率增加的转基因供体小鼠。这样我们可以确定对我们的抗原特异的B细胞的数目，并且这些将容易通过流式细胞术和elispot鉴定。然而，野生型小鼠也将对NP响应，只是以较低的频率 B1.8 ^+/-Jκ^+/- BALB/c小鼠
  注意：B1.8KI BALB/c小鼠（Sonoda等人，1997）产生并保持在JκKO上菌株（Chen等，1993）以富集λ⁺ NP-特异性B的频率细胞。将B1-8KI +/+ JκKO /- 小鼠与BALB/c小鼠 Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）产生B1.8 +/- Jκ^+/- BALB/c 小鼠，其用于初始对照和NP ^{+ 的转移细胞用于产生MBC。
  ...... 材料和试剂
  小鼠
  可以使用任何供体小鼠，只要供体和受体具有相同的背景菌株（即BALB/C进入BALB/c或B1/6进入B1/6）以防止排斥问题。我们选择具有对我们的感兴趣的抗原NP特异的B细胞频率增加的转基因供体小鼠。这样我们可以确定对我们的抗原特异的B细胞的数目，并且这些将容易通过流式细胞术和elispot鉴定。然而，野生型小鼠也将对NP响应，只是以较低的频率 B1.8 ^+/-Jκ^+/- BALB/c小鼠
  注意：B1.8KI BALB/c小鼠（Sonoda等人，1997）产生并保持在JκKO上菌株（Chen等，1993）以富集λ⁺ NP-特异性B的频率细胞。将B1-8KI +/+ JκKO /- 小鼠与BALB/c小鼠 Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）产生B1.8 +/- Jκ^+/- BALB/c 小鼠，其用于初始对照和NP ^{+ 的转移细胞用于产生MBC。
  ......... EasySep™（阴性选择）小鼠B浓缩鸡尾酒，0.5 ml
  
  EasySep™生物素选择鸡尾酒，1 ml（4°C存储）
  
  EasySep™磁性颗粒，1 ml（存储在4°C;离心机开启，冷却至4°C）
  
  正常大鼠血清，1ml（-20℃保存）}
  RPMI-1640（含有L-谷氨酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
  胎牛血清（GE Healthcare HyClone ^TM）
  HEPES 1M（Corning Incorporated，目录号：25-060-Cl）
  链霉素/青霉素，10,000U/ml（Life Technologies，Gibco ，目录号15140-122）
  
  2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3128）
  PBS（不含Ca 2+ 2 + /Mg sup 2 + （Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-023）
  乙二胺四乙酸（EDTA）0.5M溶液（pH 8）（Thermo Fisher Scientific，目录号：25783）
  
  2.5％抗凝血柠檬酸葡萄糖溶液[ACD（A）]（Polymed，目录号：7300）
  ACDA来自血库（ http://www.polymedicure.com/?wpcproduct=acd-bag ）。每100 ml ACD 溶液-A含有2.2g柠檬酸钠，0.73g柠檬酸，2.45g 葡萄糖和100ml水。
  
  NP结合试剂：NP-别藻蓝蛋白（APC）（Shlomchik lab）
  
  抗CD4（GK1.5）（Shlomchik实验室）
  
  抗-FcγRIII/II（2.4G2）（Shlomchik lab）
  
  抗CD19（1D3.2）（Shlomchik lab）
  
  27针，1毫升注射器
  
  单乙酰胺（EMA）2mg/ml（Molecular Probes）
  
  完成媒体（见配方）
  
  EasySep介质（参见配方）
  
  传输缓冲区（请参阅配方）
  
  染色介质（见配方）
  
  设备
  无菌罩
  
  冷冻台式离心机
  
  血细胞计数器
  
  "EasySep"磁体（最大体积8ml;最小体积250μl）（STEMCELL Technologies，目录号：18001）
  
  程序
  B细胞的分离
  将离心机温度设置为4°C
  每个脾脏一个培养皿在冰上的冰桶，每个培养皿5毫升完全培养基。
  
  安乐死小鼠。
  
  取死的老鼠无菌罩解剖。
  
  去除脾脏。将脾脏置于冰上完整培养基的培养皿中。
  
  研磨幻灯片的磨砂表面之间的脾脏直到混合物相当均匀。（替代品包括使用破碎脾脏注射器的尖端或使用其他方法）。冲洗幻灯片完全介质并将剩余的液体通过过滤器转移到a 15 ml锥形管。在收集其他脾脏时保持冰上。
  
  在4℃，400RCF离心细胞10分钟。
  注意：这可以在8-15分钟之间变化，这取决于离心机，可用时间以及对细胞丢失的担心。
  
  从离心机中取出管。滗入一个容器与一个swift 运动（在罩子里，保持无菌）。将剩余的沉淀重悬通过轻敲滗析后的介质。
  
  添加ACK（每个脾4ml）溶解红细胞。在室温下孵育4分钟。在此期间孵育，去除结缔组织和裂解细胞的膜，聚集在一起，看起来像白色的细丝或"鬼魂"，使用巴斯德吸管。
  
  使用完全培养基将锥形管填充至顶部，倒置混合并在4℃，400RCF下再次离心10分钟。
  
  真空吸干液体（在无菌条件下），并重悬沉淀通过轻敲滗析后的剩余介质。结合所有脾脏（保持性别分开）。
  
  在血细胞计数器中计数每个样品。搜集 10μl等分试样，用PBS中的台盼蓝1:10稀释。计算 100×10 6细胞/ml所需的体积（活细胞）（稀释）（10 4次）=细胞/ml; （细胞/ml）（体积）=总细胞
  [总细胞]/[100×10 6细胞/ml] = 10 8个细胞/ml所需的体积
  
  在95％EasySep培养基和5％大鼠血清中以10 8个细胞/ml重悬至正确的体积。
  
  EasySep B细胞富集
  注意：按照制造商的说明进行更改。
  对于处理500μl-8.0ml样品（<8.0×10 8个细胞）
  保存用于FACS的细胞预去除的等分试样
  准备细胞在具有5％正常大鼠血清的培养基中以1×10 8个细胞/ml悬浮。地点细胞在14ml（17×100mm）聚苯乙烯管中。
  
  添加负选择鼠标B细胞浓缩鸡尾酒以50μl/ml。充分混合并在冰上孵育15分钟
  添加生物素选择鸡尾酒在100微升/毫升。充分混合并在冰上孵育15分钟。
  
  混合磁性颗粒以确保它们处于均匀悬浮液中通过剧烈移液5次或快速涡旋。添加磁性颗粒在100μl/ml。充分混合并在冰上孵育5分钟
  将细胞悬浮液加入总体积为5ml（对于<4×10 8个细胞）或10ml（对于4-8.5×10 8个细胞），通过加入培养基无大鼠血清。轻轻吸取管中的细胞混合2-3次。
  
  将管（无盖）放入磁铁。在室温下放置5分钟。
  
  拿起磁铁，在一个连续的运动反转磁铁和管，将所需级分倒入新的14ml管中。离开磁铁和管在倒置位置2-3秒，然后返回直立姿势。不要摇晃或吸掉可能残留的任何液滴挂在管口上。
  
  使用血细胞计数器计数细胞
  通过流式细胞术检查纯度和抗原特异性细胞百分比保存至少2 x 10 ⁶个细胞用于染色
  置于96孔板中进行染色
  在280RCF，4℃离心4分钟
  准备抗体混合物，假设每个样品50μl，抗体混合物：NP-APC，CD19-太平洋蓝，CD4-FITC。
  通过快速反转来确定水槽中的残余体积。
  
  将沉淀的细胞重悬于50μl染色培养基中
  向每个孔中加入50μl抗体混合液。
  
  用移液管上下混匀。
  
  在冰上孵育20分钟，用铝箔覆盖
  加入100μl染色培养基。
  
  在280RCF，4℃离心4分钟
  通过快速反演确定水槽中的残余体积。
  
  将沉淀的细胞重悬于〜175μl染色培养基中
  在280RCF，4℃离心4分钟
  通过快速反转来确定水槽中的残余体积。
  
  重悬在175μlPBS中的沉淀。
  
  在进入流式细胞仪设施之前，立即将样品从96孔板转移到试管中
  在流式细胞仪上运行前，每个样品加入0.02μl的EMA。
  
  鼠标注入
  确定所需的单元数。我们将转移每个小鼠100万抗原特异性细胞。我们将通过流式细胞术确定样品中抗原特异性B细胞的百分比，然后相应地转移细胞的总数。我们还通过流式细胞术测定了B细胞的纯度百分比。 B细胞的纯度通常为90％以0.2ml体积静脉内注射悬浮在转移缓冲液中的每只小鼠的100万个NP + B活细胞。
  
  代表数据
  
  图1.在给予NP特异性B细胞并在明矾中用NP-CGG免疫的AM14-Tg xVκ8R-KI受体小鼠脾细胞的流式细胞术，8周后评估。与轮廓区域相邻的数目表示活细胞中CD19 + NP +抗原特异性B细胞的百分比。（来自Zuccarino-Catania等人，2014）
  
  图2.在没有转移NP特异性B细胞的明矾中用NP-CGG免疫的AM14-Tg xVκ8R-KI小鼠的脾脏B细胞的流式细胞术，如图1所示在8周后评估。（来自Zuccarino-卡塔尼亚等，2014）
  笔记
  
  通常在无菌罩中解剖小鼠，使脾细胞收获后保持无菌。细胞应保持冷的任何时候以最小化转移前的死亡和活化（在冰上或在4 °C冰箱）。
  另一个选择，而不是B细胞富集，是做补充消耗T细胞。这有点便宜，可能产生类似纯度水平。我们决定从一开始就使用EasySep方法并得到好的结果，所以我们继续这种方法。这很重要使用富集B细胞而不激活B细胞的方法。我们也想避免转移T细胞从我们的捐助小鼠，以避免任何拒绝问题（我们的收件人完整的初始T细胞，会有助于记忆B细胞的产生以及供体T细胞）。
  
  食谱
  填写媒体
  443.5ml RPMI-1640 w/L-谷氨酰胺（或向500ml RPMI中加入5ml L-葡萄糖）
  50ml胎牛血清
  5ml HEPES（10mM） 1 ml链霉素/青霉素
  0.5ml 2-巯基乙醇（50mM）组合原料和过滤器
  保存在4°C冰箱直到需要
  
  EasySep媒体
  244.5ml不含Ca 2+的1x PBS + /Mg ^{2 +}
  0.5ml 0.5M储备EDTA（最终为1mM） 5ml 2％小牛血清
  
  传输缓冲区
  50ml无1×PBS的PBS +无菌过滤的 2 + /Mg 0.5 ml 10 mM HEPES
  0.25ml链霉素/青霉素
  1.25ml 2.5％ACDA
  
  染色介质
  1 L 1x PBS，不含Ca 2+ 2//Mg ^{2 +}
  30ml胎牛血清（3％终浓度） 2.5ml NaN 3+原液（0.04％）
  
  致谢
  该协议在耶鲁大学的Mark Shlomchik实验室中开发或修改。由国家卫生研究院（R01-AI46303至M.J.S）和NSF研究生研究奖学金（G.V.Z.-C.）支持。该协议改编自Tomayko等人（2010）和Sweet等人（2013）。
  参考文献
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  Prak，E.L.和Weigert，M。（1995）。轻链替换：抗体基因重排的新模型。 J Exp Med 182（2）：541-548。
  
  Shlomchik，M.J.，Zharhary，D.，Saunders，T.，Camper，S.A。和Weigert，M.G。（1993）。自身抗体调节的类风湿因子转基因小鼠模型。 Int Immunol 5（10）：1329-1341。
  
  Sonoda，E.，Pewzner-Jung，Y.，Schwers，S.，Taki，S.，Jung，S.，Eilat，D.and Rajewsky，K。等位基因包含条件下的B细胞发育。免疫力 6（3）：225-233。
  
  Sweet，R.A.，Cullen，J.L。和Shlomchik，M.J。（2013）。类风湿因子B细胞记忆导致快速，转换的抗体形成细胞反应。 em Immunol 190（5）：1974-1981。
  
  Tomayko，M.M.，Steinel，N.C.，Anderson，S.M.and Shlomchik，M.J.（2010）。切缘：鼠记忆B细胞亚群的成熟度层次。 Immunol 185（12）：7146-7150。
  
  Zuccarino-Catania，G.V.，Sadanand，S.，Weisel，F.J.，Tomayko，M.M.，Meng，H.，Kleinstein，S.H.，Good-Jacobson，K.L.and Shlomchik，M.J.（2014）。 CD80和PD-L2定义独立于抗体同种型的功能上不同的记忆B细胞亚群。 a> Nat Immunol 15（7）：631-637。}}}