材料和试剂

C。 elegans 应变
GK70 unc-119 （ed3）III; dkIs37 [Pact-5-GFP-pgp-1; unc-119（+）]
大肠杆菌 OP50菌株（获自Caenorhabditis Genetics Center）
德克萨斯红葡聚糖（40,000MW）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：D-1829）
盐酸左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L9756）
琼脂糖（Nacalai Tesque，目录号：01158-85）
蛋缓冲区（参见配方）
M9缓冲区（请参阅配方）
琼脂糖垫（见配方）

设备

硅化管（1.7ml）（National Scientific Supply，目录号：20172-945）
台式离心机（Hitachi Koki，型号：CT15RE）
共聚焦激光扫描显微镜系统（Olympus，型号：FV1000）
四个干净的玻璃载玻片和盖玻片

程序

将同步的L1幼虫放置在大肠杆菌（大肠杆菌）OP50接种板上，并在20℃下孵育3天。
从OP50接种的板中挑取约30-40只成年动物，并将其转移到在1.7ml硅化试管中的500μl蛋缓冲液中。
让动物在重力下沉降几分钟。取出上清液，用500μl卵缓冲液洗涤3次
除去大部分上清液，留下约10-20μl的蠕虫悬浮液，并加入100μl含有1mg/ml德克萨斯红葡聚糖的蛋缓冲液。
在室温孵育动物90分钟，偶尔轻轻搅拌每30分钟。
通过在400×g离心2分钟收集动物，并弃去上清液。用1ml鸡蛋缓冲液洗涤至少3次。
注意：尽可能减少蠕虫悬浮液中的德克萨斯红葡聚糖。
向蜗杆悬浮液中加入1M盐酸左旋咪唑，最终浓度为10〜20mM
将蜗杆悬浮液转移到载玻片上的1.5％琼脂糖垫上，盖上盖玻片
用共焦激光扫描显微镜观察动物（见图1）

图1.表达GFP-PGP-1的动物饲喂德克萨斯红葡聚糖。 GFP-PGP-1和德克萨斯红葡聚糖标记的肠顶端膜（大箭头）和肠腔），分别。当肠上皮细胞的连接密封完整时，通过饲喂摄取的德克萨斯红葡聚糖被限制在肠腔中（Carberry等人，2012）。 A. RNAi介导的C的敲低。秀丽隐杆线虫亚单位（CCT-5）使微小杆菌肌动蛋白丝和微管解体，导致肠顶端膜的异常形态（Saegusa等人，2014）。在这样的动物中，由GFP-PGP-1（秀丽隐杆线虫P-糖蛋白同源物）标记的顶膜形成从顶膜卷入的气泡样膜结构（B，小箭头）。这种结构含有德克萨斯红葡聚糖（B，小箭头）。相比之下，含有GFP-PGP-1的囊泡下面的根尖膜（B，小箭头）不包含德克萨斯红葡聚糖，表明这些是胞吐囊泡。使用FV1000共焦显微镜系统获得图像。 GFP-PGP-1;激发：473nm，检测：490-540nm。德克萨斯 - 红葡聚糖;激发：559nm，检测：575〜675nm。比例尺表示10μm。

笔记

虽然德克萨斯红葡聚糖在该喂养方法中没有被肠细胞有效摄取，但是一些其它的顶端内吞标记物如罗丹明葡聚糖（emamine）和德克萨斯据报道，红色BSA可用于可视化内吞小泡（Grant等人，2001）。
紧密连接组分例如密蛋白（CLC-1-4，秀丽隐杆线虫）的消耗引起葡聚糖缀合物从肠腔渗入体腔（Asano等人，，2003）。

食谱

蛋缓冲区
118 mM NaCl
48 mM KCl
2mM CaCl 2 2 / 2mM MgCl 2/
25 mM HEPES
pH 7.3
注意：这种溶液比线虫组织的M9更具生理等渗性（Grant et al。，2001）。
M9缓冲区
42mM Na 2 HPO 4
22mM KH 2 PO 4 sub/
86 mM NaCl
1mM MgSO 4
琼脂糖垫（预先准备）
1. 在微波炉中在M9缓冲液中融化1.5％琼脂糖，并将其转移到玻璃管
2. 通过将管放置在65℃的加热块中使琼脂糖保持在熔融状态。
3. 将干净的载玻片放在两个玻璃片之间，两端贴上标签带
4. 将1.5％琼脂糖放在中心载玻片上，放置另一个清洁滑块在顶部，垂直于其他三个幻灯片
5. 琼脂糖凝固后轻轻取下顶部垂直的载玻片。
6. 在干燥之前使用琼脂糖。

致谢

这项工作得到了JSPS KAKENHI Grant号26291036，住友基金会，内藤基金会和医学和药物研究所的莫希达纪念基金会（到Ken Sato）的支持。该协议已经改编自Saegusa等人（2014）。

参考文献

Asano，A.，Asano，K.，Sasaki，H.，Furuse，M。和Tsukita，S。（2003）。 Caenorhabditis elegans中的紧密连接蛋白：它们在上皮中的分布和屏障功能。 Curr Biol 13（12）：1042-1046
Carberry，K.，Wiesenfahrt，T.，Geisler，F.，Stöcker，S.，Gerhardus，H.，Uberbach，D.，Davis，W.，Jorgensen，E.，Leube，REand Bossinger，）。新型肠丝组织器IFO-1有助于上皮完整性与ERM-1和DLG- 发展 139（10）：1851-1862
Grant，B.，Zhang，Y.，Paupard，M.C.，Lin，S.X.，Hall，D.H.and Hirsh，D。（2001）。证据RME-1，一个守恒的。 elegans EH结构域蛋白，在胞吞循环中的功能。 Cell Biol。 3（6）：573-579。
Saegusa，K.，Sato，M.，Sato，K.，Nakajima-Shimada，J.and Harada，A.and Sato，K。（2014）。 Caenorhabditis elegans chaperonin CCT/TRiC is 需要肌动蛋白和微管蛋白生物发生和微肠在肠上皮细胞中的形成。 Biol。 Cell 25（20）：3095-3104。