数据

蛋白质 - 蛋白质相互作用数据
应该编制所研究的蛋白质家族的相互作用的综合列表。由于相互作用数据通常仅对其序列已经沉积在数据库中的蛋白质产生，因此最近公布的研究中的蛋白质家族的全面系统发生可以产生预期的相互作用数据的数量和系统发生宽度的上限估计。在许多情况下，最近发表的系统发育关系需要从出版物本身提取，然而越来越多的系统发育正在上传到在线数据库，如TreeBASE（ http://treebase.org/treebase-web/home.html ）或Dryad（
http://datadryad.org/）。
1. 为了获得蛋白质 - 蛋白质相互作用的数据，数据库可能使用。这些数据库的突出例子包括BioGRID （ http://thebiogrid.org/）（Chatr-Aryamontri等人，2013年），数据库的互动蛋白（ http://dip.doe-mbi.ucla.edu/）（ Salwinski等 al。，2004），IntAct（ http://www.ebi.ac.uk/完整/）（Orchard ，，2014）和String（ http://string-db.org/）（Franceschini em>，2013）提到但少数。首先，UniProt（ http://www.uniprot.org/）（UniProt 2015）提供了对多个这些数据库的交叉引用便于搜索潜在的互动伙伴
2. 而且数据库搜索提供了一个很好的起点，他们经常没有捕获所有可用的信息。因此，建议进行文献检索。应特别强调从系统发育的信息性蛋白质获得信息，即从占据系统发育中的关键位置的蛋白质用于解析特定特征的状态（即）字符状态）。很多时候，这些是早期分歧的谱系它们（包括更多衍生的分类群）确保整体捕获分类群的系统发生宽度。它可能会证明用于获得蛋白质的新实验数据系统发育特别丰富。事实上，生成新的蛋白质 - 蛋白质相互作用数据通常与字符状态组合重建以更好地理解蛋白质 - 蛋白质的进化相互作用（Liu等人，2010; Melzer等人，2014; Li等人，2015）。

序列检索
用于系统发生重建的蛋白质或核苷酸序列可以从NCBI核苷酸收集中获得（ http：//www.ncbi .nlm.nih.gov/nuccore ）或NCBI蛋白质收集（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ）。

软件

对于序列比对和随后的系统发生重建，可以使用一个或几个以下程序：

表1.序列比对和系统发育重建程序

程序	目的	参考
ExPASy翻译	核苷酸序列翻译成氨基酸序列	（Artimo ，，2012） http://web.expasy.org/translate/
Clustal 2	序列比对。适合于密切相关的序列。	（Larkin等人，2007） http://www.clustal.org/clustal2/
MAFFT7	序列比对。适合紧密以及更遥远的相关序列。	（Katoh和Standley，2013） http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
RevTrans 1.4	将氨基酸比对转换为密码子比对	（Wernersson和Pedersen，2003） http://www.cbs.dtu.dk/services/RevTrans/
MEGA 6	序列比对和系统发育重建	（Tamura et al。，2013）http://www.megasoftware.net/
MrBayes 3	系统发育重建	（Ronquist和Huelsenbeck，2003） http://mrbayes.sourceforge.net/index.php

整理字符矩阵
Microsoft Excel或类似的电子表格应用程序
对于字符状态重建：
Mesquite 3.02（Maddison和Maddison，2015）（ http://mesquiteproject.org/）
Mesquite还提供了大量文档：（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/）

程序

编译字符矩阵
构建包含蛋白质的名称及其相互作用性质的字符矩阵。这可以使用Excel电子表格。或者，可以直接在Mesquite中输入数据（图1）。可以在单独的列中整理几个交互伙伴的信息。为了用Mesquite（见下文）进行可能性字符状态重建，必须对数据进行分类编码，即对于无交互，"0"和对于交互"1"。交互状态未知的组合留空。理论上，也可以引入三个或更多个类别，例如'0'：无交互; '1'：弱相互作用; '2'强的互动。然而，需要注意的是，类别仍然是离散的并且不遵循层次结构（例如没有约束，因此进化必须从'no'进行到'weak' "强"互动）。
相互作用的编码可以通过相互作用伙伴的系统发生历史而变得复杂。考虑其中蛋白质A与某种模式生物体中的蛋白质B相互作用的实例。在另一个生物体中，可以存在一个A的直向同源物，称为A ^{'，但是可以存在两个B的同向直系同源物（B ^和）。如果A ^'与B ^'交互，而不与B ^"交互，则难以将交互状态分配给A ^{sup>（图2）。一个折衷是指定A ^'作为交互，只要观察到与B ^'或B ^" et al。，2014）。如果只有不完整的数据集可用，情况会变得更加复杂。例如，假设A ^'不与B ^"交互，但是关于A ^'和B ^{之间的交互的信息}不可用。在这种情况下，可以将A ^'的相互作用状态指定为未知，以避免在数据集中包含假阴性（Melzer等人，2014）。很难估计这些问题在特定数据集中出现的频率。因此，重要的是考虑角色状态重建中的相互作用伴侣的系统发育历史如果收集的交互数据依赖于不同的方法，则还有助于分别收集每种方法的数据（图1）。这将稍后揭示字符状态重建的结果是否取决于该方法用于获取交互数据

图1.在Mesquite中的字符矩阵的屏幕截图。蛋白质名称列在第二个（有色）列中。交互特征在后续列中列出。关于同源二聚化以及与其它蛋白的异源二聚化的数据和用不同技术（Y2H：酵母双杂交; EMSA：电泳迁移率变动分析）获得的数据在不同的列中汇总。

图2.重复可能使编码相互作用复杂化。蛋白A和B在物种1中相互作用（如双箭头所示）。在物种2中，A'与B'相互作用，但与B"不相互作用。这提出了如何编码A'的交互状态的问题。}}

系统发育重建
涵盖所研究的所有蛋白质的系统发育需要使用许多可用的软件工具之一来构建（例如MrBayes，MEGA 6，Bali-Phy，PhyML，也参见表1）。关于系统发生重建中的基本概念和方法的概述，参见De Bruyn等人（2014）。可以使用所研究的蛋白质的序列构建系统发育。然而，原则上每个树可以使用，只要每个蛋白质被分配到树中的特定位置。上述和系统发生树中所述的字符矩阵中的蛋白质名称必须相同，以便以后能够连接两个数据集。 Mesquite还提供手动绘制树的可能性;这可以用于其中计算系统发生重建是不可行的情况。
系统发育可以包含不能获得相互作用数据的蛋白质。这些将稍后被字符状态分析忽略。

字符状态重建
字符状态重建使用Mesquite完成。有关如何处理Mesquite的一般说明，可以访问"Mesquite ProjectTeam"YouTube频道（ https：//www。 youtube.com/channel/UCfSmgC0O_dWLI0PEoXZbS4Q ）。

导入/生成树：
Mesquite允许从其他的导入树文件（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/Tree ）。如果树从NEXUS文件中读取，说明Mesquite不能处理一些如果存在于蛋白质名称中的特殊字符（例如 dash）。什么时候导入系统发生树，分支长度将在以后采取考虑字符状态重建。如果是手动使用绘制的树，所有分支长度将默认设置为1。这在许多情况下可能工作良好，但应该牢记来自早期分歧类群的蛋白质可能具有人为短分支（图3）。但是，Mesquite也允许编辑分支长度（ https://mesquiteproject.wikispaces.com/Trees ）。
A                                                                                                  B
在绘制树时默认显示的分支                与长度成正比的分支

图3.在Mesquite中手动绘制的树的屏幕截图。 A.分支是默认显示，以便所有提示达到相同的水平。然而，分支长度默认设置为一，如可以在B中看到的，其中相同树的分支与长度成比例地显示（参见缩放在树的右侧）。这揭示了一些分支（例如导致Amborella trichopoda AmAP3的）可能是不合理的短。

导入/生成数据矩阵：
有几个生成或导入在Mesquite中实现的数据矩阵的方法（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/Characters+%26+Matrices ）。一个直接的方法是生成一个新的空白数据矩阵所需的字符数，并复制/粘贴交互数据原始数据源（来自Excel电子表格的即）。矩阵需要被指定为用于字符状态的分类重建

模型规范和字符重构：
Mesquite提供了关于不同设置的详细文档用于字符状态重建： http://mesquiteproject.wikispaces.com/Ancestral+States 。在我们的分析我们使用可能性重建方法（Melzer等人，2014），但是简约重建（Li em et al。，2015）。二一般模型可以用于可能性重建："马可夫 k-状态1参数模型'（Mk1）和'不对称马尔可夫k-状态2 参数模型"（AsymmMk）。这两者之间的主要区别模型是2参数模型允许"向前"和"向后" 速率是不同的，即获得和失去的概率交互可以不同。在1参数模型中，失去互动同样可能。生物学上，它会大多数情况下应用2参数模型更有意义，一个可能假设它比失去交互更有可能失去交互。然而，几个报告显示，2个参数模型可以导致如果小到中等大小的数据集（数据小于 100蛋白质 - 蛋白质相互作用）（Mooers和Schluter， 1999; pagel，1999）。可以使用似然比测试来推断是否 2参数模型显着改善模型的拟合数据与1参数模型相比（Page1，1999; Ree和 Donoghue，1999）。该测试通过减去-log进行从两个模型导出的概率值并乘以结果的绝对值为2（|（-logL subMk1） - （ - logL AsymmMk）| 2）。的结果数可以用作卡方检验的检验统计量具有一个自由度。该测试也集成在Mesquite中可以通过Analysis：Tree>当前树的值> 不对称似然比检验。
在Mk1和AsymmMk模型中，字符的演化速率由Mesquite估计（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/Processes+of+Character+Evolution# param ）。但是，也可以创建具有特定的自己的模型参数（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/Ancestral+States#editingModels ）。这可以是有用的，例如，如果获得的概率vs. 从先前的实验证据知道失去相互作用。

评估结果：
最好使用饼图在内部节点可视化结果树（图4）。梅斯基特提供了进行的可能性字符状态重构同时在不同系统发育树。此外，可以一次跟踪几个字符。这个便于比较一个的字符状态重建蛋白与不同的配偶或字符状态的比较基于用于测定蛋白质 - 蛋白质的不同方法的重建互动。

导出选项：
梅斯基特可以导出树木和字符矩阵（ http://mesquiteproject.wikispaces.com/Interactions+with+Other+Programs）。对于字符状态重建的图形表示结果，我们建议将树导出为PDF并使用此文件使用诸如Adobe的图形软件进行进一步的后处理插画。对于字符状态演化的直接比较两个不同的性状可以利用镜像树功能（图 4）。

代表数据

图4.镜像树比较植物转录因子亚家族的同二聚化（左）和异源二聚化（右）的字符状态重建的结果。内部节点的饼图表示存在的概率）或不存在（黑色）的相互作用。在末端位置（例如左侧树上的

Petunia hybrida PHTM6）的阴影圆圈和内部节点的灰色圆圈表示未知的相互作用状态。

致谢

该方案改编自以前发表的研究（Melzer等人，2014）。这项研究得到了DFG授予G.T.和R.M.（TH417/5-2）的支持。 R. M.获得卡尔 - 蔡司基金会的博士后研究生支持。

参考文献

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