材料和试剂

细菌培养物[铜绿假单胞菌（<铜绿假单胞菌] PA14]。此方法也已在大肠杆菌（BW25113）
中进行
LB肉汤Lennox（BD，目录号：240230）
（Thermo Fisher Scientific，目录号：61-277-RF）的紫杉醇和/或盐酸吡咯烷
BacLight ^TM RedoxSensor ^TM CTC Vitality Kit（Thermo Fisher Scientific，目录号：B34956）
在DMSO（Thermo Fisher Scientific，目录号：S11351）中的SYTO <40>蓝色荧光核酸染料-5mM溶液
氯化钠（VWR International，BDH ，目录号：0241-VBD）
铝箔
缠绕的Masterflex过氧化物固化的硅氧烷管，L/S 14,250英尺（Cole-Parmer，目录号：UX-96407-14）
Masterflex Norprene管（A60G），L/S 13,50英尺（Cole-Parmer，目录号：UX-06404-13）
PVDF有倒钩的Y型连接器，3/8"ID，1/4"，2-3/8"，1-3/4" Pack Of 10（Cole-Parmer，目录号：WU-30703-93）
直型连接器，清除PP，1/16"ID，1/32"，25/32"，1/4"（Cole-Parmer，目录号：WU-30506-00）
倒钩连接器，清除PP，1/8"x 1/16"ID，3/32"，13/16"，1/8"（Cole-Parmer，目录号：WU-30506-06） />
倒钩接头，T型连接器，Kynar，1/4"ID，1/8"，1-15/16"，1-5/16" 10/pack（Cole-Parmer，目录号：WU-30703-75）
微量移液器（P1000，P200，P20）
注射器10毫升
针头
玻璃显微镜载片（25×75×1mm）
玻璃显微镜盖玻片（60×24mm;无2）
盐水（见配方）

设备

蠕动泵（Cole-Parmer，目录号：EW-07553-80），带有8通道，6个辊，3挡Ismatec小型泵头（Cole-Parmer，目录号：EW-78002-50）
接口（VWR ^®套筒塞）（VWR International，目录号：89097-534）
GeneMate Incubated Shakers（BioExpress，目录号：H-2000-M）
Nalgene ^® Carboys with Handles，Polypropylene，Thermo Scientific（VWR International，目录号：16101-084）
Nalgene ^® Top Works ^TM无菌封闭系统，硅胶，用于瓶和瓶，Thermo Scientific（VWR国际，目录号：2135-8303）
Acro ^® 50通风过滤器，Pall Laboratory（VWR国际，目录号：28143-616）
阳极化传输流动池反应器（Biosurface technologies，目录号：FC81-A1）
共聚焦扫描显微镜和分析软件（例如 Leica Confocal SP5成像系统和软件）

软件

COMSTAT软件（ http://www.comstat.dk ）
强度亮度V1软件（ http://bingweb.binghamton.edu/~scraver/IL.html ）
ImageJ软件（ http://imagej.nih.gov/ij/）
Leica LAS AF软件（Leica）

程序

以下程序描述如何评估存在于生物膜内的持续细胞的呼吸活性。然而，该方法可以适应于总体生物膜群体。在该方法中，使用差异染色，其中使用产生荧光甲an（CTF，由红色染色的细胞表示）的单四唑鎓氧化还原染料5-氰基-2,3-二甲苯基四唑氯化物（CTC）评价呼吸活性）减少。所有细胞用核酸染色SYTO 40染色。

流动池反应器中的生物膜发展
1. 在细菌的冷冻原液的LB琼脂上制备条纹板感兴趣（在这种情况下为绿脓假单胞菌 PA14）并孵育静置条件在37℃，24小时
2. 从条纹板上除去2个菌落，并接种5ml LB肉汤的肉汤培养物
3. 在37℃下搅拌（220rpm）孵育12-24小时
4. 在锥形烧瓶中的50ml新鲜LB培养基中稀释过夜培养物至1％
5. 在37℃下搅拌（220rpm）孵育24小时
6. 测量过夜培养物的OD 600，并将培养物标准化，使其在10ml LB中具有OD 600 = 0.8。
7. 用10ml注射器用针头吸出培养物，然后盖上针
8. 接种每个流动池反应器。
  1. 在该实施例中，在流动池反应器中培养生物膜（图1），如先前所述（Sauer等人，2002; Davies and Marques，2009; Marques等人，2014）。每个流动池反应器用3ml标准化的过夜培养物（OD 600为0.8）接种，并在静态条件下温育1小时至1小时促进细胞附着。
    
    图1.流动池反应器系统。这是一个一次性通过连续培养系统。一旦细菌培养物接种到接种口，生物膜上发育盖玻片的流动池反应器。只有底部反应器被标记，顶部反应器以相同的方式设置。一个流动池反应器组被标记。 A.流动池系统的示意图其中2个流动池一起运行。 B.流动池反应器。
9. 在室温下孵育1小时 - 以允许细菌附着到盖玻片（这一次可以变化，取决于细菌应变） - 启动流动。
10. 允许生物膜发展为在室温下6天的时间（时间和温度可以变化，取决于使用的细菌种类）
11. 在第6天暴露P。铜绿假单胞菌PA14生物膜与环丙沙星（150×MIC）或盐水（对照）一起培养18小时。
  注意：当评估整体成熟生物膜群体时，不持续细胞群，在第6天进行步骤12 也可以在生物膜发育的不同日期进行评估。
12. 将剩余的生物膜暴露于含有SYTO 40（5μM）和的盐水中 CTC（5mM），持续60分钟。 CTC以前已经用过确定生物膜内细菌的呼吸活性（Schaule等人，1993）。
  1. 当试图确定的影响某些化合物对持续细胞活性，执行此步骤30 分钟。应该开始进行的治疗这一步。
13. 采取生物膜细胞簇的几个z堆栈图像已通过共聚焦扫描在流动池盖玻片上发展激光显微镜（CSLM）使用以下激发/发射参数：
  1. SYTO 40：ex 405，em 450-455
  2. CTC：ex 476，em 650-680。
  3. 如果进行步骤12a，则在30分钟后，暴露生物膜群体对盐水或测试剂，与SYTO 40（5μM）和CTC（5mM）处理另外60分钟。
14. 量化相对荧光与程序强度亮度V1软件。这个程序通过确定图像上存在的相对荧光量化绿色，蓝色和红色荧光。我们提供了一个链接的软件，其中包含如何使用它的说明; 我们开发了该程序，并将其提供给其他研究人员免费软件
  1. SYTO 40（蓝色）将染色所有细胞，而CTC染色（红色）将仅染色呼吸活性细胞。因此，100％的细胞将染成蓝色，使得可以确定哪个百分比人口在60年期间经历呼吸活动（红细胞） min。如果然后执行步骤12a和13c，则结果获得初始30分钟应作为基线。在这种情况下的持续细胞，持续细胞和整体之间的差异人口将被评估。
15. 进行定量分析生物膜，使用COMSTAT软件（Heydorn等人，2000）。更新版本的COMSTAT软件现在可用，并且有一个插件启用它与ImageJ的使用。
  1. 这个程序被广泛使用生物膜研究人员确定和量化：总生物膜生物量，生物膜簇厚度，细菌占据的切片部分，生物量的表面积和表面与生物体积的比率。蓝色通道（总）和红色通道（呼吸活动）图像，并且控制和治疗之间的呼吸活性的差异执行。在持续细胞的情况下，两者之间的差异持续细胞和总体人群。
16. 至评估呼吸活性，比较总细胞（SYTO 40）和CTC染色的细胞（呼吸活性细胞）。
17. 重复实验3-4次，以确保可重复的数据并允许计算所得结果是否具有统计显着性当使用ANOVA将对照与处理的样品进行比较时， Tukey的比较测试。

代表数据

我们的实验室利用这种类型的测定法来评估脂肪酸信号分子顺式-2-癸烯酸（顺式-DA）是否会增加 em> P。铜绿色持续细胞存在于生物膜中（Marques等人，2014）。如上述方法所述培养生物膜，然后暴露于环丙沙星（150mg/L）24小时。随后，将仅由持续细胞组成的剩余生物膜群体暴露于含有SYTO 40和CTC的盐水中30分钟（以获得染色测量的基线），然后暴露于盐水或顺式-DDA（100nM）的盐水溶液。通过共聚焦扫描激光显微镜（Leica Confocal TCS SP5 Imaging System with DMI 6000 inverted microscope）使用上述方法中描述的参数显现生物膜。使用Leica LAS AF软件采集图像。在存在顺式-DA的情况下，与暴露于由10％增加（P <0.0001）组成的单独的盐水（图2A）相比，观察到CTC染色的显着增加（红色图）。我们还观察到持续细胞显示呼吸活性，这表明活性代谢状态，尽管是2.5％（图2B），低水平没有目视观察到（图2A）。

图2.P的呼吸活性。在暴露于顺式-DA时，绿脓杆菌PA14存留细胞。 A.呼吸活性通过细胞在用盐水孵育1小时后将CTC代谢为荧光甲's的能力来评价或顺式-dDA。 SYTO 40用于染色总体人群;条等于25μm。 B.计算持续细胞的CTC染色群体与SYTO 40染色群体相比的百分比。误差线表示标准偏差。 *，P <0.001 - 与单独用盐水处理的持续细胞显着不同，如通过单因素方差分析所示。 [版权^© 2014，美国微生物学会（Marques ，2014年]]

笔记

背景测量的图像使用共聚焦显微镜，应该在生物膜初始暴露于CTC和SYTO 40后25分钟获取。对于CTC和SYTO 40的第二次暴露应当仅在获得所有背景图像时开始。

食谱

盐水
8.5克氯化钠 1升蒸馏水（DI）

致谢

使用CTC和SYTO 40的呼吸活性测定是先前公开的方案的修改（Schaule等人，1993）。 COMSTAT分析基于先前公布的软件（Heydorn等人，2000）。这项工作得到了SUNY结构基金的支持。

参考文献

Davies，D.G.and Marques，C.N。（2009）。脂肪酸信使负责诱导微生物生物膜中的分散。 J Bacteriol 191（5）：1393-1403
Heydorn，A.，Nielsen，A.T.，Hentzer，M.，Sternberg，C.，Givskov，M.，Ersboll，B.K.and Molin，S。（2000）。新型计算机程序COMSTAT对生物膜结构的定量。微生物学 et al。，146：2395-2407。
Marques，C.N.，Morozov，A.，Planzos，P.and Zelaya，H.M。（2014）。脂肪酸信号分子顺式-2-癸烯酸增加代谢活性并将持续细胞恢复到抗微生物敏感状态。 Appl Environ Microbiol 80（22）：6976-6991。
Sauer，K.，Camper，A.K.，Ehrlich，G.D.，Costerton，J.W.and Davies，D.G。（2002）。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在发育期间显示多种表型作为生物膜。 184（4）：1140-1154。
Schaule，G.，Flemming，H.C.和Ridgway，H.F。（1993）。使用5-氰基-2,3-二甲苯基四氮唑氯化物来量化浮游和无菌呼吸细菌饮用水。 Appl Environ Microbiol 59（11）：3850-3857。