材料和试剂

移液管（BrandTech Scientific，Transferpette，目录号：704770,704770,704778,704780）
离心管（1.5ml）（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C-S）
所研究的烟草种子样品：烟草（Nicotiana tabacum）L.cv。 Petit Havana，野生型和转基因系
注意：将水稻组织蛋白基因结合蛋白（OsHBP1b）的完全开放阅读框架克隆到植物表达载体（pCAMBIA1304）中的BglII和SpeI位点，并用于农杆菌菌株（LBA 4404）的转化。使用15天龄的烟草幼苗通过组织培养方法进行转化。为了种子繁殖的目的，将推定的转基因T 0植物转移到温室中。将T sub2转基因株系的种子用于实验目的。
蒸馏H 2 O（IndiaMART InterMESH Ltd，Mars Scientific Instruments Co.，目录号：BASIC/pH& XL）
农业泥炭（Agro peat super）（AswiniAgrotech）
蛭石（Manidharma Biotech Private Limited）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
应力试剂（聚乙二醇6000或PEG 6000）（Sigma-Aldrich，目录号：81260）
抗坏血酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
液氮（Advanced Instrumentation Research Facility，Jawaharlal Nehru University，New Delhi）
过氧化氢（H 2 O 2）（Sigma-Aldrich，目录号：216763）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
Murashige&含维生素的Skoog（MS）（Caisson Laboratories，目录号：MSP09-11t）
（Sigma-Aldrich，目录号：1551128）。
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
考马斯亮蓝G-250-100mg（Sigma-Aldrich，目录号：27815）
甲醇（100％）（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
磷酸（85％）（Sigma-Aldrich，目录号：W290017）
磷酸盐缓冲液（参见配方）
Bradford试剂（见配方）
MS介质（参见配方）

设备

塑料盆（直径12厘米，深13厘米）（印度的Garden Aids）
镊子（ACE Surgical Co，目录号：10）
生长室（Daihan LabTech India Pvt.Ltd。，型号：LGC-S201）
烤箱（Hicon India）
pH计（Control Dynamic Instrumentation Pvt。Ltd.，型号：APX175E）注意：目前，它是"CD Hightech Pvt。 Ltd.，型号：APX175E"。
塑料冰盘
液氮容器（Kailash Gases，Cryocan，型号：BA-11）
汽车和杵（本地供应商，新德里）
比色杯（塑料和石英）（Sigma-Aldrich，目录号：Z276677）
分光光度计（Cary 300 UV-Vis）
图像捕获装置（SONY CORPORATION OF AMERICA，型号：DSC-HX300）
称重机（Sartorius，型号：BSA224S-CW）
刻度（30厘米塑料刻度）

软件

GraphPad InStat3软件

程序

种子发芽
1. 将Imbibe野生型（WT）和转基因烟草种子在蒸馏水中过夜
2. 允许二十二十五颗烟草种子在土壤上发芽（等量的农业泥炭和蛭石应混合准备土壤）填充的盆在生长室内在28±1℃，PPFD为 100μmol/m 2/s，相对湿度为75-80％，光周期为12/12 ?h光/暗。在土壤中每天补充50ml的MS培养基盆为植物提供营养
3. 将两周龄的幼苗单独转移到分离的充满土壤的盆中。
4. 允许WT和转基因植物生长达25天用于罐水平的耐旱测定（Lakra等人，2015）。
抗旱治疗和恢复
1. 对于干旱处理，在MS培养基中制备5％PEG溶液，补充100毫升这种溶液到花盆个别，在定期（每天一次），5或10天（Kumar等人，2012; Lakra ，2015）。
  注意：聚乙二醇或PEG是a 柔性的水溶性聚合物，它可以用于创造高渗透性压力。这些性质使PEG成为最有用的分子之一用于在植物中施加渗透压以诱导水分缺乏应激。
2. 在干旱处理5或10天后，允许植物恢复 ?通过补充50ml的MS培养基7天，随后，携带耐旱测定。
恢复后的干旱应激反应评估
WT和转基因烟草中的干旱胁迫的评价可以通过表型和生化参数的分析来进行。
表型评估
1. 作为表型参数，黄或绿叶数，根长，苗长，苗鲜重，根鲜重，苗干重和根干重可以是WT和转基因烟草植物（Lakra等人，2015）。作为代表性数据，WT的表型 ?和干旱胁迫后的转基因烟草植物（图1A）。
2. 借助标尺测量枝条和根长。
3. 对于苗和根干重，从茎中切下嫩枝和根样品植物并在烘箱中干燥72小时。随后，测量干燥通过称重机的样品重量注意：至少使用 ?每个实验的每种类型的植物的三个单独的系分析。通过GraphPad InStat3分析方差数据（ANOVA）软件。
生化评估
1. 作为生化参数，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性可以通过分光光度法测量方法。作为代表性数据，比较APX活性在WT和已经显示干旱胁迫前后的转基因烟草（图1B-C）注意：在控制下（干旱胁迫前）条件无显着性在WT和转基因之间观察到APX活性的差异植物。
2. 为此目的，称重100mg的WT和转基因烟叶组织，并使用冷冻马达分别研磨杵（图2A）注意：可以采取年轻或老的叶子，但是，应保持一致性，以从每个样品类型采集相同的老年叶。
3. 补充液氮以细碎组织。
4. 加入1毫升磷酸钾缓冲液（准备新鲜，保持在室温），然后加入0.2mM PMSF以避免蛋白质降解
5. 然后转移匀浆（图2B）微量离心管（图2C），并在10,000×g离心15分钟 min。保持离心机温度在4°C。
6. 离心后，沉淀和澄清的上清液可见（图2D）。随后，将上清液转移至新鲜微离心管（图2E），其将用作粗制的蛋白质/酶提取物，并将用于APX活性测定
7. 使用Bradford法测量粗蛋白的浓度（Bradford，1976）。使用BSA标准曲线进行蛋白质定量注意：此处可以使用以前制作的标准曲线。
8. 对于APX活性测定，使用双光束分光光度计和石英比色杯（图3A和B）
9. 制备1ml含有50mM的反应混合物（样品） K-PO 4缓冲液（pH 7.0），10μg粗酶提取物和0.35mM抗坏血酸盐。 ?通过加入5μl10mM H 2 O 2 sub启动反应。
  注意：H _{_{>和抗坏血酸应在50mM K-PO 4} 缓冲液中制备，以维持缓冲液摩尔浓度。反应式：反应在加入时立即开始 em> 2} - 依赖氧化开始。渐进在计算机屏幕上可以看到吸光度的降低启动反应。
10. 使用无H 2 O 2子分子的反应混合物作为参考
11. 按照抗坏血酸分光光度法的H 2 O 2依赖性氧化 ?通过记录290nm处的吸光度的降低（€= 2.8mM ^-1 cm ^-1）。注意：反应时间为120秒，反应温度为20℃。
12. 回顾啤酒定律表示为A =€CL其中，'A'是吸光度，是吸收系数（反映吸光度的常数效率或在选定波长处的吸收程度），"C"是物质的浓度，"L"是路径长度或比色杯的厚度。要找到解决方案的浓度，你将首先需要找到最佳拟合线的斜率。从斜坡的最佳拟合线与吸光度一起，您现在可以计算 ?该溶液的浓度（即浓度= 吸光度/斜率）
13. 这里，考虑从开始0.6分钟起290nm处的吸光度的斜率值（ΔODs-1）用于速率计算（图4）。
  注意：在这种情况下，最佳拟合线的斜率实际上是摩尔吸光系数常数和路径长度的乘积（1.00 cm）.Cary 300 UV-Vis仪器具有显示斜率值的选项 ?图表。
14. APX的活性可以由单位"μmol/min/mg蛋白质"或"μmol/min/g蛋白质"表示。
  
  图 ?WT和转基因烟草的植物形态和APX活性干旱胁迫处理后随后恢复。（A）在WT和转基因烟草中显示黄色和绿色叶片在干旱以后 ?强调。（B）WT和转基因烟草叶中的APX活性干旱胁迫处理。（C）WT和转基因烟草中的APX活性干旱胁迫处理后的叶子
  
  图2.蛋白质提取从用于测量APX活性的烟叶。（A）设置组织破碎。红色，黄色，黑色和蓝色箭头显示液体N 2容器，马达，杵和冰容器。（B）组织匀浆破碎后。（C）转移至微量后的组织匀浆离心管。（D）上清液（红色箭头）和颗粒（蓝色箭头）离心后。（E）含有粗产物的上清液蛋白/酶转移到新鲜的微量离心管中。
  
  图3.双光束分光光度计和比色皿的视图。（A）双 ?光束UV-Vis分光光度计。红色箭头显示比色杯持有人参考和蓝色箭头显示样品的比色杯架。（B）石英用于读取参考和样品吸光度的比色杯
  
  图4. APX ?活性图，其显示由于消耗的酶活性的下降。黑线表示斜率和蓝色箭头表示斜率值。

笔记

注意事项：

在花盆中植物生长需要适当维持营养培养基
光，温度和湿度应保持正常
如果在土壤表面观察到藻类生长，可以将其除去通过去除藻类层与薄的上层土壤 ?一个铲的帮助。如果看起来土壤表面正在还原在除去藻类层与一层土壤之后，另外土壤可以小心地添加到锅中而不伤害植物
在使用前应正确清洁比色杯。

食谱

磷酸盐缓冲液
制备10ml 50mM K 2 HPO 4
制备10ml 50mM KH 2 PO 4/dub 在pH计
下放置50mM K 2 HPO 4 添加所需量的KH ₂ PO ₄即可获得7.0
Bradford试剂
以考马斯亮蓝G-250 100 mg
向其中加入47ml甲醇（100％）向其中加入100 ml磷酸（85％）加入所需的蒸馏水，使最终体积为1 L
MS媒体
称取4.4mg易得的MS粉末
将4.4mg的MS粉末溶解在1L蒸馏水中
向1升MS溶液中加入30g蔗糖
调整pH 5.8

确认

作者感谢科学技术部（印度斯里兰卡计划）和大学教育资助委员会。的印度的财政支持。作者承认Lakra等人发表的以前的工作。（2015），从中采用此协议。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254。
Kumar，G.，Kushwaha，H. R.，Panjabi-Sabharwal，V.，Kumari，S.，Joshi，R.，Karan，R.，Mittal，S.，Pareek，S.L.和Pareek，集群金属硫蛋白基因在水稻中共调节，OsMT1e-P的异位表达赋予多种非生物胁迫耐受性在烟草中通过ROS清除。 BMC植物生物学 12：107
Lakra，N.，Nutan，K.K.，Das，P.，Anwar，K.，Singla-Pareek，S.L.和Pareek，A。（2015）。来自水稻的核定位组蛋白基因结合蛋白（OsHBP1b）在盐分和干旱胁迫耐受性中起作用通过保持叶绿素含量和改善抗氧化机制。植物生理学176：36-46。