材料和试剂

植物材料：拟南芥子叶和叶子，番茄叶子或柑橘叶
96％乙醇
2
NaH 2 2 PO 4 4 。 2H 2
甲基蓝（Sigma-Aldrich，目录号：M6900）
磷酸钠缓冲液（见配方）
甲基蓝溶液0.5％和0.05％（见配方）

可选

（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
荧光增白剂28（同义词Calcofluor白）（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
HCl
Tris ^。 HCl缓冲液（参见配方）
荧光增白剂溶液0.01％（参见配方）

设备

装备有Leica DC300F照相机（Leica Microsystems，型号：Leica IRB）的UV滤光器（BP 340至380nm，LP 425nm）的Leica IRB落射荧光显微镜，

软件

数码照片分析软件（如GIMP（ http://www.gimp.org ）或Adobe Photoshop（ adobe.com ）

程序

注意：使用荧光增白剂染色是可选的。这将使存在于样品中的甲壳质染色，并且可用于染色真菌。然而，使用这种染色可以掩盖胼fluorescence质发出的荧光。因此，如果实验的目的是量化胼cal质沉积，不推荐使用荧光增白剂。

染色程序
1. 该程序可用于染色拟南芥子叶和叶子，番茄叶子或柑橘叶子很少根据组织韧性的变化
2. 抽样整个叶 ?或来自植物的子叶，并将它们放置在50ml管中含96％乙醇去除叶绿素。丢弃样品 96％乙醇，直到它们显示完全白色（时间可以变化天的小叶，如拟南芥，直到一个星期柑橘叶）。饱和蒸馏96％乙醇可以替换，如果 ?必要。
3. 将样品在磷酸钠缓冲液中再水化30分钟
4. 弃去磷酸盐缓冲液，并用0.05％甲基蓝溶液覆盖样品可选：加入1/5的荧光增白剂溶液（每4ml上一步中使用的甲基蓝溶液1ml）。
5. 孵育30分钟并丢弃溶液。
6. 对于拟南芥子叶进入步骤A8。可以观察到Callose 如前所述用0.05％甲基蓝孵育3-4小时 ?由Luna等人（2011）。
7. 用0.5％甲基蓝覆盖样品溶液并在黑暗中孵育24小时。（时间可能会有所不同例子。思考样品，如柑橘叶，可能需要真空 ?行程2分钟，最多7天染色。）
8. 显微镜观察，将样品安装在具有向上表面的载玻片上使用新制备的0.05％甲基蓝
9. 观察样品具有UV滤光器的落射荧光显微镜。染色胼。质表现为荧光黄斑（图1）注意：请注意始终使用相同的扩充。
  
  A ; B ; ; C
  
  图1.番茄叶中胼cal质沉积的代表性图片 ?用荧光增白剂溶液感染灰葡萄孢菌（A），不含荧光增白剂溶液（B）。箭头突出胼。。对照叶的代表图（C）。
图像处理
1. 使用摄影软件打开图像（图2）。
  
  A
  
  B
  
  图2.分析对应于染色的胼cal质的黄色斑点使用A GIMP（GNU图像处理程序）或 B. Adob??e Photoshop
2. 使用魔术棒工具选择对应于胼cal质的亮黄色像素，或者按颜色范围选择
3. 使用直方图窗口确定像素数。
4. 将胼lose质强度表示为亮像素的平均数量/总像素数量。
  在子叶的情况下，可以计算每叶面积的黄色像素。
  有关详情，请参阅视频。
  
  视频1.使用Gimp的量化过程
  
  视频2.使用photoshop的量化过程

食谱

磷酸钠缓冲液（0.07M，pH = 9）
将溶于1L蒸馏水中的12.46g Na 2 HPO 4 Sub 2 .2H 2 O溶于溶剂中。
在100ml蒸馏水中溶解0.966g NaH 2 PO 4 PO 4·2H 2 2H 2 O。使用NaH的溶液将Na 2 HPO 4+，2H 2 2H 2 O溶液的pH调节至9， sub> 2 PO ₄ ^。 2H <2> O
新鲜制备的甲基蓝溶液
对于0.5％溶液：将0.5g甲基蓝溶解在100ml磷酸钠缓冲液中对于0.05％的溶液：将0.05g甲基蓝溶解在100ml磷酸钠缓冲液中
可选解决方案
Tris.HCl缓冲液（0.1M，pH = 8.5）将0.6057g Tris碱溶于50ml蒸馏水中，用HCl调节pH至8.5
荧光增白剂溶液
将0.0125g荧光增白剂28溶解在50ml Tris缓冲液中
将溶液在室温下避光保存

致谢

作者感谢Jaume I大学和国家R& D计划（AGL2010-22300-C03-02，西班牙资金支持。

参考文献

Chen，X.Y。和Kim，J.Y。（2009）。高等植物中的Callose合成。植物信号分析 4 （6）：489-492。

Luna，E.，Pastor，V.，Robert，J.，Flors，V.，Mauch-Mani，B.and Ton，J。（2011）。 Callose沉积：多方面植物防御反应 Mol Plant Microbe Interact 24（2）：183-193。