材料和试剂

Eppendorf型微管（0.5ml和1.5ml）（任何品牌）
LightCycler 480多孔板（白色）（Roche Diagnostics，目录号：04729749001）
用于qPCR运行的LightCycler 480密封箔（Roche Diagnostics，目录号：04729757001）
用于存储含有引物混合物的板的粘合剂PCR膜密封件（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0558）
Combitips 0.1ml（Eppendorf，目录号：0030 089.405或0030 089.618）
在体外或土壤中生长的拟南芥植物
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，目录号：74904）
水，用于分子生物学，DNAse，RNAse和无蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，ACROS Organics ^TM，目录号：327390010）
Ambion Turbo无DNA的^TM Kit（Life Technologies，目录号：AM1907）
/>
3M乙酸钠（pH 5.2）
100％和70％乙醇
琼脂糖LE，分析级（Promega Corporation，目录号：V3125）
PCR和qPCR引物（见表1）

表1.本协议中使用的引物
请点击表1的此处。
Taq聚合酶
注意：任何Taq聚合酶都可用于此步骤，我们使用家用纯化的酶。
dNTP组（Life Technologies，目录号：10297-018）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10297-018"。
Superscript III逆转录酶（Life Technologies，目录号：18080-044）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-044" 此酶含有5x转录缓冲液和0.1 M DTT溶液。
随机六核苷酸引物（Life Technologies，目录号：48190011）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，c
RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂（Life Technologies，目录号：
10777-019）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10777-019"。
LightCycler 480 SYBR I Master mix（Roche Diagnostics，目录号：04887352001）
注意：此试剂对光敏感。

设备

Nanodrop紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
'Multipette plus'（Eppendorf，目录号：4981 000.019）
LightCycler ^? 480 System（Roche Diagnostics）

软件

LightCycler 480软件版本1.5（Roche Diagnostics，目录号：04994884001）

程序

RNA提取
1. 总的拟南芥RNA从年轻组织（8至20日龄）提取叶）与RNeasy植物迷你套件根据制造商的协议。
2. 用40μl无RNA酶的水洗脱RNA，并用NanoDrop测量其浓度。
DNase治疗
在逆转录步骤之前需要除去基因组DNA 这是使用Ambion Turbo无DNA试剂盒实现的
1. 加入0.5 ml管
  最多10μgRNA（在45μl无RNA酶的水中）
  4.7μl10x Turbo DNase缓冲液
  1μlDNase
2. 通过吸移混合，并在37℃下放置1小时
3. 的 ?试剂盒含有DNase灭活剂，这导致了很大的损失材料和可能的残余树脂。相反，沉淀反应用1/10体积的3M乙酸钠和2.5至3体积的100％乙醇（30 min至-20℃下1小时）。在4℃下以最大速度（20,800×g ）旋转30分钟 ?C。小心丢弃上清液。
4. 用70％乙醇（小心地加入300μl的70％乙醇而不破坏沉淀并旋转15分钟。这一步除去盐，这将如果管在-20℃的冷冻器中保持1小时或更好地实现过夜
5. 干燥颗粒，并用30μl无RNA酶的水重悬。
6. 测量 ?浓度与NanoDrop和通过运行约100检查RNA质量在2％琼脂糖-TBE凝胶上。这是一个常规的DNA凝胶，只是使用干净缓冲液，并用0.1％SDS洗涤托盘，梳子和槽以除去核糖核酸酶。图1A显示了完整和降解的叶RNA样品
7. 的通过对稀释的RNA（1/100）的PCR证实不存在污染性DNA 使用对质体和线粒体转录物特异的引物。
  对于 ?例如，对Chloro44F和Chloro44R（扩增 rpoB ）以及 ?Mito41F和Mito41R（扩增 cox2 ）适用于该测试。
  
  Chloro44F
  GCTCCGGAGATAGTTCCCTT
  rpoB
  
  Chloro44R
  TTCTAGTTCTATCATCAGCTATGGG
  
  Mito41F
  CTCCAGCCGCTCACTGTAAT
  cox2
  
  Mito41R
  TCCGATGAGCAGTCACTCAC
  
  的 ?植物细胞中大量的质体DNA证明了其使用质体引物以检查DNase处理的效率使用1 ?μl的1/100 RNA稀释作为模板。执行程序：94℃2分钟，35个循环（94℃20秒，30秒，30秒） ?55℃，72℃1分钟），最后在72℃5分钟不要忘记阳性（基因组DNA）和阴性对照，理想情况下这个PCR应该 ?导致无扩增。当你确信没有留在RNA中的基因组DNA（参见图1B），进行cDNA合成。否则重复DNase处理
  
  图1。 A. TBE凝胶显示完整（第一泳道）和降解（第二泳道）RNA样品。乙。 PCR结果：缺乏扩增显示污染的DNA已经通过DNase处理有效去除
cDNA合成
1. 使用1-3微克无DNA的RNA（0.5微克足够在困难的情况下样品），只是确保RNA的初始量是相似的在所有样品中进行比较并同时处理所有样品。
2. 它 ?使用六核苷酸引物（引物的混合物）是至关重要的包括六个随机核苷酸），而不是该步骤的寡聚dT ?质体和植物线粒体转录物不具有polyA尾（除非注定要退化）。使用Superscript III First Strand 合成系统
3. 加入0.5 ml管
  在11μl中加入0.5-3μgRNA
  1μl10 mM dNTPs
  1微升随机引物，浓度为100 mg/ml
  在65℃孵育5分钟，然后在冰上孵育1-2分钟
4. 添加
  4μl5×转录缓冲液
  1μl0.1M DTT
  1μlRNaseOUT
  1μlSuperscipt III Reverse Transcriptase
  在25°C孵育5分钟
  在50°C孵育50分钟
  在70°C使反应停止15分钟，将样品保存在冰上或-20°C，直到准备好进行qPCR。
定量RT-PCR-一般考虑
1. cDNA可以通过第一轮qPCR使用一对来测试核引物和一对线粒体引物（参见表1）。这将允许您调整cDNA浓度（通过 ?在设置3之前比较所有样本的交叉点（C
  ） ?或6×384孔板（图2）。
  
  图2.扩增的 rpl2 。 A。标准稀释的扩增曲线对照样品（棕色曲线）和14个其他样品（红色曲线）。在绿色，阴性对照。 B.显示引物的标准曲线效率接近2.
2. 进行定量RT-PCR 384孔板（LightCycler 480多孔板） 5μl的反应体积足以作为线粒体转录物高度表达。对于qPCR运行，板是用专用的LightCycler 480密封箔密封。保持板在冰上并在黑暗中直到跑步
3. 每个5μl反应含有0.5μl 的cDNA稀释液，2.5μlLightCycler 480 SYBR I Master混合物（包括DNA聚合酶，缓冲液和DNA双链特异性SYBR Green I染料）和2μl2.5μM引物混合物（各1.25μM）。细节的连续稀释和反应混合物在表3中给出表2所示的板设置允许分析6个样品（3x 384-孔板用于每个测定），一个样品用作对照定量（3个生物学重复的野生型和3个突变体例）。每点三次技术重复（1/200稀释）必要。
4. 对每个引物对进行标准曲线，使用样品之一作为对照。将该cDNA稀释（1/20， 1/200,1/1,000,1/5,000），其余样品仅为1/200）。的通过软件计算每对引物的引物效率 ?当做标准曲线时。
5. 线粒体的引物对转录组测定在表1中描述，以及引物 ?将用于结果的归一化的参考基因。它很难找到其表达不会改变的参考基因 ?样品之间;这是一个尝试几个，挑选最多的问题在实验中合适的和组合它们。或者，可以对线粒体转录物的中值进行标准化。
6. 的 ?用于剪接测定的引物（即用于定量剪接）的线粒体mRNA）设计为扩增100-200 bp区域跨越内含子 - 外显子连接（未剪接形式）或跨接剪接每个基因的连接（剪接形式）（表1）。

移液的定量RT-PCR时间过程

准备底漆板
引物（2μl，各1.25μM）用自动分配器"Multipette plus"分配在孔中，每个水平线一个引物对（参见表2）。所有板设置阶段必须在冰上进行，或在多个情况下在冷室中进行板设置，以限制试剂的蒸发这一步可以并用板（用粘合剂PCR膜密封件密封 ?Thermo Scientific）可以保持在-20℃。

表2.用于线粒体转录组和剪接测定的384孔板
反应混合物根据表3制备并保存在冰上制备连续cDNA稀释液，并为每个稀释液加入准确体积的SYBR Master混合物。
加入3微升此混合（SYBR主混合+ cDNA）到已经包含2微升引物混合物，每个1.25微米的每个孔。

密封并短暂旋转板，保持在冰上和在黑暗中。

表3.系列cDNA稀释液和qPCR混合物

Volum e	52微升	76 μl	52微升	26微升	26微升	76μl
稀释	1/20	1/200	1/1,000	1/5,000	0	突变体/200
水	57.8微升	78.8微升	45.8微升	20.8μl	26	75.6μl
cDNA	3.04μl					0.38微升
1/20		8.75微升
1/200			11.44微升
1/1,000				5.2微升

	1/20	1/200	1/1,00 0	1/5,000	0	突变体/200
主混音	260微升	380μl	260微升	130微升	130微升	380μl
cDNA	52微升	76微升	52微升	26微升	26微升	76微升

执行 ?qPCR尽快运行。热循环程序为：95℃ ?10分钟，然后是95℃10秒，60℃10秒的45个循环 ?72℃20秒。
板设置应输入LC480 ?软件在开始运行之前，但这个可以在以后完成必要。在"绝对定量"下，填写"子集编辑器" 与文本名称和位置在盘子和最后 '示例编辑器'。

数据分析

使用内置的LightCycler 480软件版本1.5分析数据。在实时荧光的对数线性阶段开始时确定Cp值的第二微分最大方法（Luu-The等人，2005）是快速和容易的，但是适合点法也可以使用。所有转录物相对于内部对照样品定量。对于每个引物对，用内部对照样品进行标准曲线。检查PCR反应的效率（最佳效率为2，但在1.6和2.4之间是可接受的）。为使误差最小，标准误差应小于10％，但对于某些引物对，很难实现。
然后将数字复制到电子表格中，并如下进行计算：

标准化步骤是必要的：为此，使用2至3个合适的参考基因的几何平均值或归一化到所有线粒体转录物的中值。总是最好尝试几种方法。
将每个样品标准化为其对照，即，计算突变体M1与WT1，M2/WT2，M3/WT3或任何需要进行的比较的表达的比率。
绘制突变体/WT中转录物积累的第一张图。在某些情况下，使用日志₂缩放显示结果更容易（见图3）。
计算生物重复之间的平均值和标准偏差（SD）。如果平均log2比率+ SD和平均log2比率-SD之间的间隔不包含零，则认为该变化是显着的。
对于剪接测定，结果最好表示为（WT中突变体与剪接的mRNA的剪接的mRNA）与（WT中未剪接的mRNA的未剪接的mRNA）的log2比（图3A）。然而，要确保你看到的是真正的拼接缺陷的影响，你必须检查拼接的mRNA的积累在突变体中，并且未剪接的mRNA的积累在突变体中。
如果需要，可以通过Northern印迹确认结果。

代表数据

图3.代表数据。 A。图A显示了突变wtf9（Francs-Small等人，2012）的qRT-PCR线粒体剪接测定，其在rpl2中具有缺陷 em>和 ccmFc 转录本拼接。当数据表示为每个转录物的拼接至未剪接形式的相对量的log 2值时，缺陷是非常明显的。图B显示转录组数据，其中mRNA水平表示为与WT Col-0植物中的水平相比的突变体中转录物水平的比率。

笔记

由于植物组织中线粒体转录物的丰度，这些测定通常是非常可重复的和可靠的。当然，在一些突变体中，一些转录物以与WT相比显着不同的水平表达，但这是文章旨在检测的。

致谢

该协议最初由Etiennne Delannoy和AndéolFalcon de Longevial??le开发，由澳大利亚研究委员会卓越中心（Australian Research Council Center of Excellence）授予CE0561495（de Longevial??le等人，2007; Koprivova等人，/em，2010;Kühn等人，2009）。一些引物对已经被C.Colas des Francs-Small修饰或添加，特别是用于nad5剪接的研究（Colas des Francs-Small等人，2014年，）。

参考文献

Colas des Francs-Small，C.，Falcon de Longevial??le，A.，Li，Y.，Lowe，E.，Tanz，S.K.，Smith，C.，Bevan，M.W.and Small，I.（2014）。五肽复制蛋白TANG2和ORGANELLE TRANSCRIPT PROCESSING439参与多分体nad5转录物的剪接，编码亚基的线粒体复合物I. 植物生理学165（4）：1409-1416。
de Longevial??le，A.F.，Meyer，E.H.，Andres，C.，Taylor，N.L.，Lurin，C.，Millar，A.H。和Small，I.D。（2007）。五子多肽重复基因OTP43是线粒体nad1内含子1的反式剪接所必需的，拟南芥。植物细胞 19（10）：3256-3265。
Francis-Small，C.C.，Kroeger，T.，Zmudjak，M.，Ostersetzer-Biran，O.，Rahimi，N.，Small，I.and Barkan，A。（2012）。 rpl2和ccmF（C）内含子剪接所需的PORR结构域蛋白和c-在拟南芥线粒体中的类型细胞色素。植物J 69（6）：996-1005。
Koprivova，A.，des Francs-Small，C.C.，Calder，G.，Mugford，S.T.，Tanz，S.，Lee，B.R.，Zechmann，B.，Small，I.and Kopriva，鉴定与线粒体nad7转录本的内含子1的剪接有关的pentatricopeptide重复蛋白。 Biol Chem 285（42）：32192-32199。
Kühn，K.，Richter，U.，Meyer，EH，Delannoy，E.，Falcon de Longevial??le，A.，O'Toole，N.，B?rner，T.，Millar，AH，Small，ID和Whelan，（2009）。噬菌体型RNA聚合酶RPOTmp在 Arabidop 的线粒体中进行基因特异性转录> 。 21（9）：2762-2779。
Luang-The，V.，Paquet，N.，Calvo，E。和Cumps，J.（2005）。改进的实时RT-PCR方法用于使用二阶导数计算和双重校正的高通量测量。 em> Biotechniques 38（2）：287-293。