材料和试剂

蛋白质表达
1. pGAPZ A，B，毕赤酵母表达载体（Life Technologies，目录号：V200-20）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：V200-20"。
2. 用于选择的Zeocin ^TM（InvivoGen，目录号：ant-zn-5b）
3. 1％酵母提取物（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：2363.3）
4. 2％蛋白胨（BD，目录号：211677）
5. D（+） - 葡萄糖（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：X997.3）
6. 酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（见Recipes）
蛋白质纯化
1. 酸洗玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G 8772）
2. GFP-Trap （ChromoTek GmbH，目录号：gta-20）
3. NanoOrange Protein Quantification Kit（Invitrogen，目录号：N-6666）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：N-6666"。
4. 10mM Tris（pH7.5）
5. 50mM NaCl
6. 0.5mM EDTA（pH8.0）
7. 100mM甘氨酸（pH 2.5）
8. 1 M Tris（pH 10.4）
9. 稀释缓冲液（参见配方）
10. 洗涤缓冲液I（见配方）
11. 洗涤缓冲液II（参见配方）
12. 洗脱缓冲液（见配方）
GTP酶活性测定
1. GTPase测定试剂盒（Innova Biosciences Ltd.，目录号：602-0121）
2. 阴性对照：使用p表达和纯化GFP。 pastoris作为表达系统（质粒pGAPZ :: eGFP）

设备

300 ml烧瓶
摇床（160rpm）
离心机用于50ml Falcon管（3,220×g/g）
涡流
管式旋转器在4℃和室温下
Plate Reader（BioTek Instruments，型号：Synergy HTX多模式读取器）
台式离心机（冷却）

程序

蛋白质表达
1. 菌株：
  巴斯德毕赤酵母GS115
2. 表达载体：pGAPZ
3. 预培养：将来自YPD（+ zeocin）平板的一个集落孵育在4ml中液体YPD（+ zeocin）介质在28℃和160rpm下培养1天
4. 主培养：在28℃和160rpm下，在100ml新鲜YPD（+ zeocin）培养基中培养1ml预培养物3天。
5. 菌株：pGAPZ :: RabA4c-mCit [NA]/[DN]，对照 pGAPZ：e：GFP 原生形式，DN =显性阴性，请参考Ellinger等人的（2014）应变生成]。
6. 将酵母细胞转移到50ml Falcon管中，并通过离心（3220×g，10分钟，4℃）收获。
7. 弃去上清液并用无菌ddH 2 O洗涤细胞沉淀
8. 机械裂解：加入相同体积的无菌酸洗玻璃珠到细胞沉淀并涡旋珠细胞悬浮液以最大速度30秒，然后在冰上冷却30秒，重复这些步骤A8-10次。
9. 在4℃下将玻璃珠以453×g /分钟旋转2分钟
10. 转移上清液在新的2毫升管，洗玻璃珠用1ml稀释缓冲液（见上文），再次离心并转移 ?上清液也到2ml管
11. 通过在4℃的最大速度离心30分钟分离细胞碎片。
12. 转移清澈的上清液在一个新的管，并存储在4°C 直到蛋白质纯化开始。将沉淀储存在-20°C下 ?SDS-PAGE分析。
蛋白质纯化
1. 平衡25μl（一个样品）GFP-Trap_A琼脂糖珠稀释缓冲液（使用2ml试管）：用500μl冰冷稀释液洗涤3次缓冲液，在洗涤步骤之间，在4℃下将珠子以719×g离心2分钟 min并弃去上清液
2. 将粗提取物加入平衡珠子，并在4℃下在恒定下孵育样品4小时 ?混合（例如管旋转器）。
3. 在4℃下以719×g离心样品 2分钟，通过吸移小心地除去上清液。存储等分试样在4℃下进行"非结合蛋白"分析
4. 洗珠3 次，用1ml冰冷的洗涤缓冲液I和II通过离心分离 719×g 在4℃下2分钟;丢弃上清液。
5. 与感兴趣的蛋白质融合的珠子可以立即用于酶活性测定。
GTP酶活性测定（更多信息，请参考GTPase测定试剂盒手册）
GTP酶[也称为G蛋白（鸟嘌呤核苷酸结合蛋白）]用作在活性和非活性状态之间循环的分子开关。该循环与GTP的结合和水解有关。在活性状态下，这些酶与GTP相互作用以执行多种细胞功能。通过GAP（GTP酶激活蛋白）的结合发生失活。这种蛋白质将GTP水解成GDP和游离磷酸盐。为了恢复活性状态，需要酶GEF（鸟嘌呤核苷酸交换因子）来催化GTP的GDP的交换（图1）。

图1. GTP酶测定试剂盒（Innova Bioscience）的原理
1. 按照GTPase Assay试剂盒手册中所述制备底物缓冲液混合物（SB-Mix）和标准曲线的样品。
2. 向纯化的珠 - 蛋白溶液中加入350μlSB-Mix缓冲液
3. 在恒定混合下在室温下孵育样品30分钟
4. 使用台式离心机将粉碎的珠子以1,073×g 离心5分钟
5. 将100μl反应缓冲液置于96孔板的一个孔中（一式三份）并加入100μl纯H 2 O;准备样品的标准曲线以相同的方式。
6. 准备Gold-Mix缓冲液（参见GTPase Assay试剂盒手册），并向每个孔中加入50μl以终止反应。
7. 2分钟后加入20μl稳定剂。
8. 孵育板在室温下在黑暗中30分钟。
9. 读取波长为650 nm的光板（590-660 nm，参见GTPase Assay试剂盒手册）。
10. 对于酶活性的计算，按照GTPase Assay试剂盒手册的附录1（图2）
  
  图2.RabA4c-mCit [NA]/[DN]和GFP作为对照的特异性酶活性。如上所述进行GTP酶测定（程序）。误差线表示标准偏差。
SDS-PAGE和蛋白质定量
1. GTP酶测定后：从GFP-Trap_A 珠中洗脱目标蛋白通过加入200μl100mM甘氨酸（pH 2.5），短暂混合并在37℃温育室温下2分钟。
2. 加入20μl1 M TRIS碱（pH 10.4）中和
3. 在室温下将珠子以1.073×g离心2分钟，将上清液转移到新管中。
4. 蛋白质定量按照制造商的说明书（NanoOrange Protein Quantification Kit，见上），蛋白量是确定酶活性所必需的。

食谱

酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基
1％酵母提取物
2％蛋白胨
D（+） - 葡萄糖
稀释缓冲液
10mM Tris（pH7.5） 150mM NaCl 0.5mM EDTA（pH8.0）
洗涤缓冲液I
10mM Tris（pH7.5） 300 mM NaCl
0.5mM EDTA（pH8.0）
洗涤缓冲液II
10mM Tris（pH7.5） 500 mM NaCl
0.5mM EDTA（pH8.0）
洗脱缓冲液
100mM甘氨酸（pH 2.5）
1 M Tris（pH 10.4）

致谢

这项工作作为Ellinger等人的出版物的一部分进行。（2014），由联邦教育和研究部（BMBF）资助，研究重点是BioEnergy 2021："CallBio-Resistant Plants for simplified bio-ethanol production through optimized Biosynthesis of Cell Wall Polymer Callose"。

参考文献

Ellinger，D.，Gl?ckner，A.，Koch，J.，Naumann，M.，Stürtz，V.，Schütt，K.，Manisseri，C.，Somerville，S.C.and Voigt，拟南芥 GTPase RabA4c 与其效应子PMR4导致对白粉病的完全穿透抗性。植物细胞26（7）：3185-3200。