材料和试剂

BD Vacutainer 7 ml玻璃血清管，无添加剂，有机硅涂层内部（BD，目录号：366431）
Eppendorf管（1.5ml）中
T175cm 2培养瓶（Corning Inc.，目录号：431079）
12孔板培养板（Corning Inc.，目录号：3513）
15ml Falcon管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352096）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Falcon ^TM ，目录号：352096" />
胰岛素注射器27G1/2"（Terumo Medical Corporation，目录号：SS05M2713）
0.22μmMillipore Stericup TM过滤器单元（Merck Millipore Corporation，目录号：SCGPU05RE）
酒精擦拭
U2OS人骨肉瘤肿瘤细胞（ATCC），在完全DMEM（10％FBS）中生长
牛痘病毒储液≥5×10 6 pfu/ml
1x无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Hyclone，目录号：21-031-CV）注意：目前，它是"Mediatech，Inc.，Corning，目录号：21-031-CV"。
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F1051）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养基（Hyclone，目录号：10-031-CV）
注意：目前，它是"Mediatech，Inc.，Corning，目录号：10-031-CV"。
2x DMEM粉末（Life technologies，目录号：12800-017）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：12800-017"
羧甲基纤维素（CMC）（Sigma-Aldrich，目录号：C5678-1KG）
碳酸氢钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S233-500）
100x青霉素 - 链霉素（GE Healthcare，Hyclone，目录号：SV30010）
Refludan（Lepirudin）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：A412P-4）
2x DMEM溶液（参见配方）
3％羧甲基纤维素（CMC）（参见配方）
滴定覆盖介质（参见配方）
水晶紫（见配方）

设备

离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：ST40R）
生物安全柜
37℃，5％CO 2培养箱（Sanyo）
ViCell（Beckman Coulter）或血细胞计数器计数器
pH计
加热块设置为37°C和56°C
BD Vacutainer ^?按钮血液收集套装带预连接座（示例25G x 0.75英寸）（BD，目录号：367336）

程序

制备用于病毒滴定的细胞
1. 在中和实验前一天，12孔板应该 ?用以2.5×10 5个细胞/孔接种的U2OS细胞建立。 U2OS细胞 ?线是高度可感染的人骨肉瘤系牛痘病毒和形成非常一致的单层，使其理想用于牛痘病毒噬菌斑测定。 U2OS细胞在DMEM中培养 10％FBS，并且也应在相同的12孔板中设置媒体。板的数量应该对应于样品的数量其中病毒中和将被评估和解释重复或一式三份滴定。
血液收集
1. 用酒精擦拭清洁真空采集管的顶部。
2. 静脉血应由训练有素的抽血者收集 vacutainer管使用与被连接的vacutainer的蝴蝶针
3. 收集血液后立即使用胰岛素注射器，注射Refludan（70μl的100x库存的Refludan到最后浓度为50μg/ml）通过管的橡胶顶部。倒置在室温下数次（4-5次），以确保混合均匀
中和测定
1. 在Eppendorf管中每个供血者准备250μl等份的全血
2. 将剩余的血液转移到15ml falcon管中，并在室温下以800×g离心5分钟以获得血浆。
3. 收集血浆，并准备两个250微升血浆等分试样在每个供血者的Eppendorf管。
4. 热灭活每个血液供体的一个血浆样品（56℃下30分钟）以使用加热块或水浴灭活补体。
5. 作为控制来验证输入病毒的数量非中和条件，准备一个额外的管与250微升无血清培养基或PBS
6. 加入10μl制备的病毒稀释液（5× ?10 6 pfu/ml）并非常轻柔地涡旋（终浓度是2×10 5 pfu/ml）。每个样品的总体积应为260μl
7. 在37℃孵育样品1小时。
感染性病毒滴定

图1.滴定程序示意图
1. 准备6个Eppendorf管，每个样品有900μl的SFM
2. 添加100 μl的样品加入到900μl的SFM中。使用1/10连续稀释剩下的五个管。（稀释系列将为10 ^-1至10 ^-6。）
3. 将250μl稀释的样品转移到12孔板的孔中
4. 在37℃孵育1小时。每15-20分钟，板应该摇动以确保井的任何部分在最小化期间??干燥体积感染。
5. 通过抽吸完全去除接种物，并每孔加入1ml制备的滴定覆盖培养基
6. 病毒中和实验两天后，可视化使用0.1％结晶紫溶液进行噬斑测定。删除重叠式广告抽吸和洗涤孔用1x PBS。加入0.25ml 0.1％的结晶紫色溶液到孔中并在室温下孵育5-10分钟。移除结晶紫并收集在适当的容器中处置。用自来水冲洗井，并用这种废物处理结晶紫浪费。允许井空气干燥。
7. 斑块通过肉眼可见。枚举每孔的噬菌斑数，并乘以稀释因子。
8. 数据可表示为滴度（pfu/ml）或相对回收率 ?对照样品。相对恢复可以通过除以 ?通过未中和的对照的滴度测试测试样品的滴度样品（其中将病毒掺入PBS或DMEM中）。

代表数据

图2.与来自一个代表性人类供体的血液，血浆或热灭活血浆孵育后的传染性牛痘病毒恢复。数据可表示为滴度（Log 10 10 pfu/ml）），或如图B中从输入（PBS或DMEM）回收的病毒的比例。

笔记

人体血液必须在所有捐赠者的知情同意下并根据机构审查委员会批准的方案收集。关于先前暴露于所讨论的病毒（例如疫苗接种）的信息的收集对于解释实验结果可能是重要的，并且必须根据批准的方案进行。例如，在Evgin等人根据自我报告的疫苗接种状态和相对于天花疫苗接种运动结束的出生日期，对牛痘病毒实验的献血者进行分层。
已经描述了用于牛痘病毒的方案，然而可以使用适合于所讨论的病毒的滴定方法容易地适应。
抗凝剂的选择对于补体级联的评估是重要的。 EDTA，肝素和柠檬酸盐都会干扰补体激活。水蛭素及其衍生物例如Refludan是特异性凝血酶抑制剂，并且不干扰补体（Bexborn等人，2009）。
可以以任何浓度评估病毒中和。类似地，可以根据需要调节血液或血浆的体积。该方案使用2×10 5 pfu/ml的浓度，其代表在5L的估计成人人体血容量中的1×10 9 pfu的临床剂量，如描述在Evgin等人（2015）中
该方案可以适于使用各种抑制剂或阻断抗体。例如，在步骤C6之前，在Evgin等人（2015）中添加基于肽的补体抑制剂或抑制性单克隆抗体。在37℃下预孵育另外15分钟以确保肽或抗体在加入病毒之前结合。

食谱

2x DMEM（500ml）
将1包DMEM粉末溶解在500ml ddH 2 O中加入3.4克碳酸氢盐
将pH调节至7.2
通过0.22μmMillipore Stericup ^TM过滤器单元或类似的真空过滤系统过滤
加入100 ml FBS，然后滴定覆盖介质
储存在4°C
3％羧甲基纤维素（CMC）（500ml）将15g CMC粉末溶解在500ml ddH 2 O中高压灭菌器
在室温下贮存
滴定覆盖介质（500ml）
250ml的2×DMEM（+ 20％FBS） 250ml 3％CMC
5ml 100x青霉素/链霉素储存在4°C
水晶紫
将1g溶解在1L的80％甲醇，20％dH 2 O中。

致谢

该方案最初发表在Evgin等人（2015）中。这项工作由特里福克斯研究基金会，安大略癌症研究所，渥太华地区癌症基金会和加拿大健康研究所支持。

参考文献

Bexborn，F.，Engberg，A.E.，Sandholm，K.，Mollnes，T.E.，Hong，J.and Nilsson Ekdahl，K。（2009）。水蛭素与肝素用于全血在体外生物相容性模型。/a> J Biomed Mater Res A 89（4）：951-959。
Evgin，L.，Acuna，SA，Tanese de Souza，C.，Marguerie，M.，Lemay，CG，Ilkow，CS，Findlay，CS，Falls，T.，Parato，KA，Hanwell，D.，Goldstein，A Lopez，R.，Lafrance，S.，Breitbach，CJ，Kirn，D.，Atkins，H.，Auer，RC，Thurman，JM，Stahl，GL，Lambris，JD，Bell，JCand McCart，JA 2015）。补体抑制防止免疫人类和食蟹猴中溶瘤性痘苗病毒中和。 Mol Ther 23（6）：1066-1076。