材料和试剂

50ml用于处理收获培养物的塑料管（VWR International，目录号：62406-200）
0.45μm注射器过滤器（VWR International，目录号：28145-477）
0.22μm注射器过滤器（VWR International，目录号：28144-050）
30ml注射器（VWR International，目录号：66064-760）
1.5ml Eppendorf管（VWR International，目录号：89213-152）
200目形成的TEM网格（Electron Microscopy Sciences，目录号：EMS200-Cu）
Nunc?MicroWell?96孔光学底板（带盖玻璃底座）（Thermo Fisher Scientific）
< em>野生型菌株DZ2（UC Regents，Berkeley）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（VWR International，目录号：97064-158）
荧光脂质染料FM 4-64（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：T-13320）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号： -13320 "。
乙酸乙酯（Electron Microscopy Sciences）
10mM MOPS（pH7.6）
2mM MgSO 4
10％（w/w）Bacto casitone
5％（w/w）细菌酵母提取物
CYE Media（见配方）

设备

无菌侧臂250 ml锥形瓶
摇动培养箱（例如 Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ4000）
Vortexer
离心机，容量为25ml培养物，5000×g（不需要冷藏）
超离心机，具有1ml样品的容量，140,000×g所需的并且需要冷藏。（如 GMI，Beckman Coulter，型号：L8-70M）
超离心管（适合机器规格）
-80°C冰箱
荧光板读数器（例如，Tecan Trading AG，型号：Vission-100）
透射电子显微镜（Philips/FEI，型号：5350NE Dawson Creek Drive），其能够在配备有2k×2k CCD照相机的，在80kv和200kV之间的电压下对负染色的样品成像
高压灭菌介质和烧瓶（或进入无菌培养基和生长容器）。

软件

数字显微照相软件和2k×2k CCD照相机（Gatan Inc.）

程序

为了获得外膜囊泡和囊泡链的无细胞制剂，从3-21天的CYE培养皿上的再分枝收获黄单胞菌株DZ2（野生型）细胞，并接种到带有25ml液体CYE培养基（10:1体积的烧瓶：应当维持黄色有氧培养物的培养物比例的体积）的250ml锥形瓶中。单个25ml培养物足以分离?200μg的OMV用于进一步分析
在Thermo Scientific MaxQ4000中，将培养物在200rpm，32℃下振荡生长2天至OD 600 = 2.0（?2×10 9细胞/ml）摇动培养箱。
将培养物转移至50ml离心管中并涡旋30秒以分散聚集体并释放囊泡。请注意，对于 M。 xanthus），大细胞聚集体是常见的，并且当适应其它细菌物种时，可能不需要这种持续时间的涡旋。培养物应在室温下处理3-6个步骤，因为冷温度破坏细胞活力并影响分馏。
将涡旋的培养物在5,000xg离心10分钟以沉淀全细胞。
将上清液通过0.45μm注射器过滤器过滤以除去任何剩余的细胞。
将滤液如步骤4进一步离心，然后通过0.22μm注射器过滤器以除去碎屑。
然后使用超速离心机在4℃下将无细胞滤液进行140,000×g离心1小时以收获外膜囊泡，囊泡链和膜管，其将在所得沉淀中并重悬浮于1 ml PBS。
然后将样品保存在-80℃或立即进行分析。通过下述两种方法分析样品，以（a）通过荧光脂质染料结合监测囊泡部分的纯度，和（b）通过电子显微镜监测囊泡部分的纯度和质量。还可以进行另外的分析，例如，蛋白质组分析已经表明OMV蛋白部分与来自任何其它大蛋白复合物的很少或没有污染一致。
1. 将样品等分试样与荧光脂质染料FM 4-64混合（作为100μg干燥原液购买，在-20℃下储存直至使用）至最终 ?体积为100μl，终浓度为16μM。相对使用黑色96孔测定囊泡样品的浓度板和荧光读板器通过在515nm激发，测量发射在640nm。分析了5个独立的样品生物制剂，作为混合物是异质的。 16μMFM 4-64 in PBS应该用作阴性对照，而全细胞级分可以 ?用作阳性对照。荧光单位可以变化，但是成功的制剂应该是10-40倍或更高的阴性控制读数。 1：1如果需要，可能需要连续稀释样品信号饱和发生。产量随细胞密度的增加而增加和相对于需氧的稳定表面生长培养物（生物膜）液体培养物，但是约200μg或更多可用该方案获得。
2. 阴性染色的TEM样品通过应用3μl的 OMV样品以3次重复至200网孔形式涂覆的TEM网格，允许3分钟沉淀并在蒸馏水中短暂漂洗。一个 2.0％的乙酸铀溶液用于覆盖网格立即吸干并风干。样品在FEI上成像 CM200显微镜用2k×2k Gatan CCD照相机或在JEOL 1200上显微镜，分别在200kV或120kV下工作，具有质量通过囊泡和囊泡链的存在来判断和缺乏 ?细胞或细胞碎片。关于EM过程的更多细节，参见Remis等人 ?al。（2014a），有关EM程序的视频，请参阅Rames等人（2014b）。

笔记

其他EM分析方法[SEM，树脂包埋切片TEM，冷冻水合囊泡样品的冷冻EM（Remis等人，2014）]也可用于该评估，但是负染色TEM提供此信息的最简单的技术。光学显微镜单独，由于其有限的分辨率，通常不能提供对囊泡纯化的准确评估

图1. EM的TEM图像。 xanthus OMV（来自Remis等人，2014），其显示独立的OMV和OMV链。

食谱

CYE媒体
10mM MOPS（pH7.6） 2mM MgSO 4 10％（w/w）Bacto casitone
5％（w/w）细菌酵母提取物高压灭菌
灭菌

致谢

该协议改编自以前的工作（Berleman等人，2014; Palsdottir等人，2009; Remis等人，2014年）。这项工作由美国能源部生物和环境研究办公室的实验室指导的研究开发资金支持，合同号为DE-AC02-05CH11231（给Manfred Auer）和美国能源部VFP计划（给James E. Berleman）。

参考文献

这些研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果表明，。黄豆球菌外膜囊泡的致命货物。前微型生物 5：474.
Palsdottir，H.，Remis，J.P.，Schaudinn，C.，O'Toole，E.，Lux，R.，Shi，W.，McDonald，K.L.，Costerton，J.W.and Auer，三维大分子组织的冷冻固定的黄色粘球菌生物膜如电子microscopic tomography。 191（7）：2077-2082。
Remis，J.P.，Wei，D.，Gorur，A.，Zemla，M.，Haraga，J.，Allen，S.，Witkowska，H.E.，Costerton，J.W.，Berleman，J.E.and Auer，细菌社会网络：黄豆粘球藻外膜囊泡链的结构和组成。 Environ Microbiol 16（2）：598-610。
Rames，M.，Yu，Y。和Ren，G。（2014b）。优化的负染色：用于通过电子显微镜检查小的和不对称的蛋白质结构的高通量方案。/a> J Vis Exp （90）：e51087。