材料和试剂

制备叶绿体脂质膜的脂质
1. Amersham Protran Premium NC0.2（GE Healthcare，Dharmacon，目录号：AP-10600081）
2. TLC硅胶60板（Merck Millipore Corporation，目录号：105721）
3. 熔融硅石毛细管柱，0.25mm×50μm（Shinwa Chemical Industries，目录号：HR-SS-10）
4. 蓝细菌的细胞，集胞藻。 PCC 6803（脂质提取）
5. 甲醇（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：137-01823）
6. 氯仿（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：038-02601）
7. 0.01％甘菊糖（Sigma-Aldrich，目录号：206865）在80％丙酮中
8. 十五烷酸（Sigma-Aldrich，目录号：91446-5G）
9. 甲醇HCl（Sigma-Aldrich，目录号：33050-U），用甲醇稀释3次
10. 己烷（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：085-00411）
脂质 - 蛋白质相互作用测定
1. PIP条，膜脂质条（Echelon Biosciences，目录号：P-6001和P-6002）
2. Hybri-Bag（Cosmo Bio，目录号：S-1001）
3. 来自牛血清（BSA），不含脂肪酸的白蛋白（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：017-15146）
4. 纯化的标签蛋白
5. 将抗penta-His小鼠单克隆抗体（QIAGEN，目录号： ?34660）和抗GST小鼠单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：G1160）
6. 辣根过氧化物酶（HRP）结合山羊抗小鼠二次抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号码：31432）
7. HRP底物溶液（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：NCI32132）
8. 磷酸盐（pH 7.4）
9. NaCl
10. 0.1％Tween-20
11. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
12. PBST（参见配方）

设备

玻璃管（Iwaki，目录号：71-088-004和71-063-006）
巴斯德吸管（Sansyo，Iwaki，目录号：IK-PAS-9P）
分光光度计（Scinteck Instruments，Pharmacia Biotech，型号：Ultrospec 2000）
涡流搅拌器
离心机（TOMY SEIKO CO。，型号：LC-120）
真空干燥器（Shimadzu Corporation，型号：SPE-200离心蒸发器）
TLC显影室（AS ONE，目录号：CK-0544-060）
吹风机（市售）
紫外照明灯
剃刀刀片
热块
气相色谱仪（Shimadzu Corporation，型号：GC-18A）
熔融硅石毛细管柱，0.25mm×50μm（Shinwa Chemical Industries，目录号：HR-SS-10）
数据处理器（Shimadzu Corporation，型号：C-R2AX）

程序

叶绿体脂质膜的制备
1. 通过离心收集蓝细菌细胞并悬浮收集 ?细胞在2ml的0.9％KCl中。 3×10 9个细胞的集胞藻PCC 6803是足够[通过分光光度计测定细胞数。在730nm处的光密度（OD 730）= 1.0对应于1×10 8个细胞/ml ?为 Synechocystis PCC 6803]。
2. 加入7.5ml甲醇：氯仿（2:1，v/v）并涡旋1分钟。
3. 加入2.5ml氯仿和2.5ml H 2 O，并涡旋。
4. 在700×g离心10分钟。收集下相，放入清洁管并在真空干燥器中干燥。测量管的重量使用前和干燥后脂质。计算脂质的产量。
5. 将干燥的脂质溶解在氯仿中，浓度为10mg/ml。
6. 将显影溶剂加入TLC显影室中，关闭离开30分钟，如图1所示。显影溶剂为丙酮：苯：超纯水= 91:30:8（v/v/v）。点氯仿溶液包含1-3mg脂质到TLC板上，板进入TLC显影室。
  
  图1.分离脂质在TLC板上。1.将显影溶剂加入TLC显影液中室; 2.将脂质溶液滴加到TLC板上并放置板进入腔室; TLC板在室中显影单独的脂质
7. 当溶剂前沿达到1cm时从板的顶部，从室中取出板并干燥用吹风机提供的凉风。
8. 喷雾0.01％ 80％丙酮。脂质被视为长点下的斑点波长的UV光如图2所示。标记相应的位置并从每个斑点中刮掉硅胶该TLC板是用硅胶包被的草板。硅胶 ?可以用刀片从刀片上刮下
  
  图2。通过UV显现的蓝藻脂质的薄层色谱。总计 ?从蓝藻中提取的脂质被开发丙酮：苯：超纯水= 91:30:8。颜料; 2.单葡糖基二聚甘油; 3.单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）; 4。半乳糖基二酰基甘油（DGDG）; 5.磺基奎诺糖基二酰基甘油（SQDG）; 6.磷脂酰甘油（PG）。
9. 加入1毫升氯仿至从板上刮下的硅胶并涡旋。旋转下移硅胶并将上清液转移到新管中。重复此操作萃取3次，并在真空干燥器中蒸发氯仿。溶解得到的脂质在100μl氯仿中。以下10?12 需要步骤来确定获得的脂质的产量
10. 取5μl含有每种脂质的氯仿溶液到新管中 ?并加入50nmol的十五烷酸作为内部标准品和2.5ml 3％（w/v）甲醇HCl。关闭管子螺帽，并在80℃下孵育3小时。在孵化期间脂肪与脂质结合的酸衍生为脂肪酸甲酯。
11. 将管冷却至室温后，加入2.5ml己烷 ?大力涡旋。用己烷萃取脂肪酸甲酯。静置5分钟，收集上相（己烷相），放入并且在真空干燥器中蒸发己烷。
12. 将获得的脂肪酸甲酯溶于50μl己烷中用气相色谱仪分析它们。注射器的温度，柱和检测器室设置在250℃，170℃和250℃，分别。通过计算总量来确定脂质含量基于脂肪酸甲酯的峰面积的脂肪酸甲酯酯。十五酸不是包含在蓝藻脂质中，因此它可以用作内部标准。
13. 用氯仿稀释脂质（在步骤A9获得的脂质）至0.1,1和10mg/ml。
14. 点样脂质对应于0.1，1和10毫克/毫升在1微升氯仿置于Amersham Protran Premium膜上并完全干燥。
脂质 - 蛋白质相互作用测定
1. 孵育膜与5ml封闭溶液（3％无脂肪酸 ?BSA在PBS中）在室温下温和搅拌1小时。
2. 弃去封闭溶液，孵育膜2毫升包含0.5μg/ml标记蛋白（His-标记的或 GST标记的蛋白）在4℃过夜。把膜和溶液进入Hybri袋并密封。
3. 丢弃蛋白质溶液和在室温下用10ml PBST洗涤膜三次每次温和搅拌10分钟。
4. 丢弃解决方案和将膜与2ml含有一级的封闭溶液孵育抗体（抗penta-His小鼠抗体1:2,000）或抗GST小鼠单克隆抗体1:2000）在室温温育1小时搅动。将膜和溶液放入Hybri袋中并密封
5. 弃去溶液并用10ml PBST洗涤膜三次次，在室温下温和搅拌10分钟。
6. 弃去溶液，并用2ml封闭液孵育膜溶液（HRP-缀合的山羊抗小鼠抗体1:20000）在室温下温和搅拌1小时。将膜和溶液放入Hybri袋中并密封
7. 弃去溶液并用10ml PBST洗涤膜三次次，在室温下温和搅拌10分钟。
8. 孵育膜与足够的HRP底物溶液，以覆盖膜（2至3毫升）在室温下5分钟。
9. 用超纯水洗涤膜以终止反应并干燥膜
10. 扫描膜以记录所获得的数据。

代表数据

图3.脂质 - 蛋白质相互作用测定的代表性结果左侧（PIP条带）和中间膜（膜脂质条带）上的每个点含有100pmol脂质。右膜含有叶绿体脂质，MGDG，DGDG，SQDG和PG，并且还含有心磷脂（CL）作为对照。将膜与0.5μg/mL GST-PDV2一起温育。使用的缩写是：LPA，溶血磷脂酸; LPC，溶血磷脂酰胆碱; PI，磷脂酰肌醇; PI3P，磷脂酰肌醇3-磷酸; PI4P，磷脂酰肌醇4-磷酸; PI5P，磷脂酰肌醇5-磷酸; PE，磷脂酰乙醇胺; PC，磷脂酰胆碱; PI（3,4）P 2，磷脂酰肌醇3，4-二磷酸酯; PI（3,5）P 2，磷脂酰肌醇3,5-二磷酸酯; PI（4,5）P 2，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯; S1P，鞘氨醇1-磷酸; PI（3,4,5）P 3，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸; PA，磷脂酸; PS，磷脂酰丝氨酸; TAG，三酰基甘油; DAG，1,2-二酰基甘油。该图像从参考文献2重印，获得来自植物细胞的许可;版权所有美国植物生物学家协会（www.plantcell.org）。

食谱

PBS
10mM磷酸盐（pH7.4） 150mM NaCl
PBST
PBS
0.1％Tween-20

致谢

该协议改编自原始工作（Okazaki等人，2015），以提供详细的程序。这项工作得到JSPS KAKENHI Grant号26840089的支持。

参考文献

Bligh，E.G。和Dyer，W.J。（1959）。总脂质提取和纯化的快速方法。 Can J Biochem Physiol 37（8）：911-917
Okazaki，K.，Miyagishima，S.Y.and Wada，H。（2015）。磷脂酰肌醇4-磷酸负调节拟南芥中的叶绿体分裂。植物细胞 27（3）：663-674。
Sato，N。和Murata，N。（1988）。膜脂质 Meth Enzymol 167：251-259。< br />