第I部分。测量AID在E中的诱变活性。大肠杆菌
以下程序改编自Petersen-Mahrt等人（2002）。它通过选择赋予利福平抗性的rpoB基因中的那些突变提供了AID突变大肠杆菌基因组的能力的测量。它可以用作酶的催化活性的代表，虽然它涉及转录的基因的脱氨作用，其可能影响结果。当比较不同的AID变体或突变体时，其提供与wt酶相比的诱变活性的测量，wt酶经常但不总是与在DNA寡核苷酸底物上测量的相应重组酶的酶活性相关。

材料和试剂

无菌多通道水槽
主管大肠杆菌。我们使用BW310菌株（Duncan，1985）（来自亚特兰大Emory大学医学院病理学博士Bernard Weiss博士的礼物）
含有AID或AID变体的质粒克隆在诱导型原核表达载体中。我们使用IPTG诱导的pTrcHis载体（Life technologies，目录号：V360-20）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen?，目录号：
胰蛋白胨（BioShop Canada，目录号：TRP402）
酵母提取物（BioShop Canada，目录号：YEX401）
氯化钠（NaCl）（BioShop Canada，目录号：SOD002）
琼脂（细菌学级）（BioShop Canada，目录号：AGR001）
（BioShop Canada，目录号：SMP400）。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（BioShop Canadap，目录号：PPM666）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A0171）
氨苄青霉素（ddH 2 O中储备100mg/ml）（BioShop Canada，目录号：AMP201）
羧苄青霉素（在ddH 2 O中为100mg/ml）（BioShop Canada，目录号：CAR666 ）
利福平（DMSO中的100mg/ml储备液）（Sigma-Aldrich，目录号：R3501）
IPTG（ddH 2 O中的储备液1M）（BioShop Canada，目录号：IPT001）
透明无菌96孔板，平底（Corning，目录号：3595）
LB媒体（见配方）
LB琼脂（见配方）
2x TY介质（参见配方）
5x M9介质（参见配方）

设备

本生灶
无菌玻璃珠（用于细菌电镀）（Genlantis，EZ-spread，目录号：C400050）
37℃培养箱（细菌板）
37°C带振荡器的培养箱（用于细菌培养）
42℃水浴
手动计数器
多通道移液器

程序

制备多个补充有利福平（100μg/ml）+氨苄青霉素（100μg/ml）的10cm LB琼脂平板作为样品进行测试（选择平板）。还准备必需数量的添加氨苄青霉素（100μg/ml）用于初始转化的LB琼脂平板和实验中的活力平板（见下文）。例如，为了比较3个构建体，制备用于细菌转化的补充有氨苄青霉素的3个平板，加上用于测定的氨苄青霉素（总共18个氨苄青霉素平板）的3×5 = 15个平板，以及补充有利福平+氨苄青霉素的15个平板。

第1天：变革
1. 对于每个构建体，将50ng DNA与50μl感受态BW310在无菌的1.5ml Eppendorf管中混合
2. 在冰上孵育30分钟。
3. 在42℃水浴中热冲击45秒。
4. 将试管放回冰中5分钟。
5. 通过将整个体积的细菌转移到含有950μl2×TY培养基的1.5ml Eppendorf管中，并置于振荡培养箱中，在37℃下以230rpm持续45分钟，来回收细菌。
6. 将40μl来自第5点的每种细菌培养物置于LB-氨苄青霉素板上，并在37℃下孵育过夜
第2天：挑选菌落并诱导AID表达
1. 从每个转化平板（即构建体）中挑取至少5个分离的菌落到含有1.5ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的LB培养基的15ml管中。
2. 在37℃下生长过夜。
第3天：电镀
1. 选择板
  1. 将50μl每个诱导培养物在具有LB利福平+氨苄青霉素的10cm培养皿中平板接种
  2. 在37℃下孵育?48小时，直到菌落清晰可见注意，集落大小可以是异质的，因为不同的突变将允许利福平的不同生长速率。此外，低活性或活动过度的AID变体可能需要特异性平板（即更大的体积或分别稀释样品），以获得可以精确计数的多个集落。不要将体积小于50μl，以防止菌落的过快吸收和聚集。
2. 活力板
  1. 为了方便，使用无菌96孔板和多通道移液器，在1×M9培养基中进行10倍连续稀释的诱导培养物。稀释到10 ^-6
  2. 在50cm培养皿LB氨苄青霉素中加入50μl的10 ^-6。
    注意：取决于生长，诱导和表达的条件，可能需要其它稀释度（10μM-4μM或10μM-50μM）以获得许多菌落可以轻松准确地计数（图1）。
  3. 在37℃下孵育过夜
第4天：计数LB氨苄青霉素平板
第5天：计数LB利福平板
注意：计算所有菌落。在利福平板的情况下，计数所有大小的菌落。如果有太多的菌落（即小的和靠近在一起），可以计数板的1/2-1/4以估计菌落的总数而不影响测量的精确度，只要可以区分分离的菌落。如果菌落是汇合的，重复实验，不复制保持过夜的培养物，因为存活力显着降低。如果菌落太少或没有菌落，测量可能不准确;重复并调整体积或稀释度，以相应地。

图1.用pTrc-His（Ctrl）和pTrc-His-AID（AID）转化的细菌在37℃下温育两天的LB氨苄青霉素+利福平板的实施例
计算rpoB突变频率
1. 对于每个培养物，使用公式计算每ml的菌落形成单位（CFU）的数量（N） N =（n×d×Vo）/Vp
  n：板中计数的菌落数; d：稀释因子; Vo：原始培养体积（μl）; Vp：电镀体积（μl）
  LB氨苄青霉素平板将提供活的CFU/ml（N V），LB利福平平板将提供突变体CFU/ml（N ）
2. 计算每10个p CFU的利福平抗性（RIF ^R）突变体的数目为：
  
  计算对于每个构建体获得的所有值的中值R f ^R/10 ^{9，并且使用适当的统计方法根据比较的样品数量评价显着性。为了精确比较AID变体之间的相对频率，至少需要3个独立实验，每个结构具有5个菌落}

食谱

注意：培养基必须在制备后进行高压灭菌，并保持无菌。

LB培养基（对于ddH 2 O中的1L）
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
5克NaCl
LB琼脂（对于LB培养基中的1L）
LB媒体
15克琼脂
2x TY介质（对于ddH 2 O中的1L）
16克胰蛋白酶
10g酵母提取物
5克NaCl
5x M9培养基（对于ddH 2 O中的1L）
64g Na 2 HPO 4 sub 。 7H O
15克KH 2 PO 4 4/
2.5克NaCl 5g NH 4 Cl

第二部分。测量AID在DT40细胞中的体细胞超突变活性
DT40细胞是在质膜上组成型表达IgM的鸡B细胞淋巴瘤细胞系，以及AID（Arakawa等人，2002）。鸡通过基因转化（基于同源重组的机制）使其Ig基因多样化。然而，这里使用的DT40衍生的细胞系（DT40ΔΨVIgM ⁺）已经被工程化以消除作为基因转化的同源性供体的V假基因，导致AID脱氨作为突变累积，主要在C：G对具有针对颠换突变的偏向（Arakawa等人，2004）。以下方案利用了在Ig基因座处AID诱导的突变的一部分将破坏IgM表达的事实。这可以通过流式细胞术定量为IgM丢失细胞，并且是监测SHM频率的方便代理。当从DT40ΔΨVIgM ⁺群体开始时，IgM丢失细胞的比例是细胞在培养中花费的时间以及直接取决于AID活性的SHM频率的函数。其中AID表达也已通过敲除（KO）消除的DT40ΔΨVIgM ⁺品系可以用编码AID或AID突变体的表达载体来补充，所述突变体用GFP标记或通过内部核糖体进入位点，以便比较它们对SHM的相对能力。 GFP表达用于监测感染效率并仅评估感染细胞上的IgM丢失。

材料和试剂

6孔板，无菌和组织处理（Corning，目录号：3516）
24孔板，无菌和组织处理（Corning，目录号：3526）
96孔板，圆底，无菌和组织处理（Corning，目录号：3799）
15毫升无菌锥形管
1.5 ml Eppendorf管
5ml圆底管（facs管）
HEK 293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
DT40AIDKOΔΨVIgM +/- 细胞（这些是非贴壁细胞）（Arakawa等人，2004）（来自JM Buerstedde博士，爱尔兰国立大学戈尔韦）
DMEM培养基（Wisent，目录号：319-005-CL）
RPMI 1640培养基（Wisent，目录号：350-000-CL）
FBS（Wisent，目录号：080150）
鸡血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：16110-082）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：
青霉素 - 链霉素（Wisent，目录号：450-201-EL）
β-巯基乙醇（BioShop Canada，目录号：MER002）
TransIT-LT1试剂（Mirus Bio LLC，目录号MIR 2305）
聚凝胺（8mg/ml，在水中）（Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
HEPES 1M（Wisent，目录号：330-050-EL）
小鼠抗鸡IgM-PE（SouthernBiotech，目录号：8310-09）
PBS（1x）（BioShop Canada，目录号：PBS404）
BSA（BioShop Canada，目录号：ALB001）
编码VSV G包膜蛋白（pVSVG）的表达载体
MLV多蛋白和逆转录酶（pGagPol）的表达载体编码
含有AID变体和选择或报道标记的逆转录病毒表达载体（我们使用pMXs-ires-GFP）
直接PCR裂解试剂（VIAGEN BIOTECH，目录号：301-C）
蛋白酶K（-20℃在水中10mg/ml储液）（Bio Basic Canada Inc.，目录号：PB0451??）
KOD（Merck Millipore Corporation，Novagen，目录号：71086-3）或Pfu Turbo（Agilent，目录号：600250-52）高保真DNA聚合酶
任何用于拖尾的Taq DNA聚合酶
QiaexII凝胶纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：20021）
pGEMT easy（Promega Corporation，目录号：A1360）
完成DMEM介质（参见配方）
完成DT40媒体（参见配方）

设备

40μm细胞过滤器
离心机
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
流式细胞仪
PCR机
烤箱
Vortex（科学工业，型号：Vortex-genie 2）

程序

第1天：将HEK 293T细胞铺板用于逆转录病毒包装
板在2ml完全DMEM培养基中的6孔板中的0.5×10 6个细胞/孔。在电镀的时刻，细胞应该是75-90％汇合
第2天：HEK 293T转染
1. 对于要转染的细胞的每个孔准备以下内容：
2. 通过在室温下轻轻敲打，将以下物质以下述顺序混合在1.5ml Eppendorf管中：
  RPMI 1640（无添加剂）250微升
  TransIT-LT1试剂7.5μl
  混合均匀，然后添加：
  pGagPol0.625μg
  pVSVG0.625μg
  逆转录病毒载体1.25μg
  注意：质粒的指示质量是为了实现1 [pVSVG]：1 [pGagPol]：2 [逆转录病毒载体]的摩尔DNA比，根据质粒大小调整质量。
3. 让坐20分钟，然后滴加到细胞中。
4. 轻轻摇动平板并在37℃下孵育。
第3天
1. 小心地从转染的HEK 293T细胞的每个孔中除去培养基
2. 向每个孔中加入2ml补充有10mM HEPES的完全DT40培养基
第4天：DT40感染
1. 转移媒体（病毒上清）从每个转染HEK 293T细胞井15毫升锥形管。以200×g离心，室温下5分钟
2. 在24孔板中，将1×10 6个DT40细胞/孔铺板在500μlDT40培养基中（细胞指数生长并以?0.5-1×10 6个细胞/应使用细胞/ml）。
3. 将1.5ml /孔的离心的病毒上清液加入铺有镀层的DT40细胞中
4. 向每个孔中加入聚凝胺至8μg/ml，HEPES至终浓度为10mM
5. 将板在600×g下在32℃下离心1.5小时
6. 将板在细胞培养孵育器（37℃，5％CO 2）中放置4小时。
7. 4小时后，从每个孔中除去培养基并加入2ml补充有10mM HEPES的DT40培养基
8. GFP感染频率可以通过流式细胞术检查，并在24-48小时后分选。根据结构，预期效率为?40-90％。
排序
注意：在无菌条件下工作。
1. 对于每个样品，制备1至4个圆底96孔板，含有200μl/孔的过滤的完全DT40培养基。
  注意：板数将取决于每孔分选的细胞数目，对于单细胞沉积，制备4个板以考虑克隆效率，对于5个细胞/孔，两个板足以用于> 5个细胞/孔一个板将足以获得足够的群体用于波动分析。
2. 将10 感染的细胞转移到无菌FACS管中
3. 在4℃下离心200分钟，5分钟。
4. 用4ml PBS洗涤并在4℃下离心200×g，5分钟
5. 在200μlPBS-1％BSA中加入抗鸡IgM-PE（1:200）
6. 轻轻涡旋混匀，在冰上和黑暗中孵育30分钟
7. 用4 ml PBS洗涤细胞，并在4°C离心200分钟 5分钟。
8. 重悬细胞在300微升PBS和过滤样品通过一个40微米的细胞过滤器
9. 以1-3,000个细胞/孔（GFP ⁺，IgM ^-）进行分类。
  注意：每个孔中排序的细胞数量将取决于应用。当初始群体较大时，表面IgM损失的波动分析将显示较小的变化。然而，当随后分析V区序列时，应该去除所有共有的突变以防止由预先存在的突变的克隆扩增引起的偏移。每孔使用1个细胞将产生单个细胞克隆，其在波动分析中具有较大的变化，但允许在测序时更准确地分析SHM。在这种情况下应分析更多的克隆以获得IgM损失的准确中值。
鉴定克隆/群体
1. 克隆/群体在分选后3-5天肉眼可见，并应转移到含有1ml经过滤的完全DT40培养基的24孔板中。分离每个转导的构建体的12-24个克隆/群体（参见上面的注释）。
2. 当细胞汇合时（分离克隆后3-4天），向每个孔中加入1ml DT40培养基。
3. 稀释1：2仔细重悬细胞使用P1000和旋转。删除1毫升的细胞，然后每天加入1毫升新鲜DT40培养基，每天，2-4周。
  注意：通过每天观察细胞来监测细胞密度。某些条件或AID变体可减缓增殖。细胞的稀释和扩增长度应相应调整。 IgM的频率应随时间增加;扩展的总时间将取决于每个特定实验的信噪比。
表面IgM的流式细胞术
1. 转移500微升的细胞从每个孔到流式细胞仪管
2. 在4℃下离心200分钟，5分钟。
3. 用4ml PBS洗涤并在4℃下离心200×g，5分钟
4. 在100μlPBS-1％BSA中加入抗鸡IgM-PE（1:200）
5. 通过涡旋混合充分，放置30分钟（在冰上和在黑暗中）
6. 用4ml PBS洗涤并在4℃下离心200×g，5分钟
7. 重悬于300μlPBS中
8. 在流式细胞仪中分析样品。获得20,000个事件。始终使用IgM +和IgM-DT40细胞混合物作为对照，以设置门控（图2）。
9. 分析每个克隆的IgM损失％，并计算每个构建体或条件的中值。统计分析。
图2.表达对照载体或pMXs-AID-ires-GFP扩增3周并染色IgM 的DT40AIDKOΔΨVIgM ⁺细胞的实施例。
可变区序列
以下程序用于扩增和测序来自每个DT40亚群的IgV L区。如果没有应用表型选择，许多序列将是未突变的。在测序的碱基总数上的突变数目将提供突变频率的精确估计。然而，获得足够的（> 50）独立突变以评价突变模式的变化可能需要大量测序。计算突变率将另外需要测量细胞的倍增时间并记录细胞扩增期间的群体倍增的总数。另一方面，IgM丢失的细胞可以通过FACS纯化，其将选择平均携带更多突变序列的细胞。后者更适合分析突变模式，但不太准确以计算突变频率
DNA提取
1. 准备DNA提取缓冲液（485微升直接PCR + 15微升10毫克/毫升蛋白酶K）注意：直接PCR需要预热，并确保任何沉淀物在使用前都溶解在溶液中。
2. 在台式微量离心机中以最大速度旋转5×10 4至5×10 5个细胞15秒。
3. 小心地清除上清液。
4. 通过上下滚动，在50 μ l DNA提取缓冲液中轻轻悬浮细胞。
5. 在55°C孵育5小时。使用烤箱而不是加热块，以防止盖子上的结露（这一步可以在一夜之间完成）。
6. 在85℃下孵育45分钟以灭活蛋白酶K.
7. 将DNA储存在-20°C或进行PCR
PCR反应
1. 使用1-5μlDNA模板作为模板。
2. 引文：
  5'-gcggggccgtcactgattgccg -3'
  5'-ccccagcctgccgccaagtccaag -3'
3. PCR必须用高保真DNA聚合酶（如KOD或Pfu turbo）进行。使用聚合酶说明书中建议的所有试剂和浓度。
4. 以50μl终体积进行PCR 注意：始终包括一个无模板控制，使用一些剩余的DNA提取缓冲液，控制可能的试剂污染。
5. 退火温度：在68-60℃下进行8个循环的接触式PCR，接着在60℃下进行23个循环，用于退火温度。延伸时间和温度以及变性温度将取决于所使用的DNA聚合酶。预期的PCR产物为520个碱基对

克隆和测序
注意：从这里开始，远离PCR罩，避免在未来的实验中与最终产品混淆。

在琼脂糖凝胶中运行50μl的PCR产物。一条520 bp的单条带应该是可见的，在水控制中应该看不到条带
凝胶根据QIAEX II试剂盒说明进行纯化。
将纯化的片段在20μl10mM Tris pH 8中洗脱

在T载体中克隆（或者，可以将限制性位点添加到寡核苷酸中或使用所选择的克隆方法） Poly-A尾（高保真聚合酶不添加A突出端）：

来自步骤K3的纯化的PCR产物	17微升
含有Mg 2+（2.5mM Mg 2+，最终）的10x DNA聚合缓冲液。	2微升
10mM dATP（0.2mM终浓度）	0.4μl
Taq DNA聚合酶	1微升