材料和试剂

8孔腔室玻片（Thermo Fisher Scientific，Lab-Tek ^{TM，目录号：154532）}
盖玻片，矩形＃1（24×50mm，0.12-0.16mm）（Corning，目录号：2975-245）
一抗
1. 兔抗KRT20（1:200）（Cell Signaling Technology，目录号：13063）
2. 兔抗溶菌酶（1:200）（Dako，目录号：EC 3.2.1.17）
3. 兔抗Muc2（1:200）/VHL抗体（M-20）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：H-300，sc-1534）
4. Villin抗体（C-19）（1:200）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-7672）
次级抗体：
1. 山羊抗兔568（1:500）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes，目录号：11036）
  />
2. 驴抗山羊594（1:500）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes，目录号：11058）
  />
3. 山羊抗大鼠488（1:500）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes，目录号：a11006）
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM ，目录号：a11006"
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10010023）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：10010023" />
多聚甲醛（PFA）16％溶液，EM级（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710-S）
新鲜制备的4％PFA在1x PME缓冲液中
ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes，目录号：P10144）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，ProLong ，目录号：P10144" />
清澈指甲油（可在当地药店买到）
可选
1. 用于细胞增殖的Click-iT EdU Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：C10340）
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：C10340" br />
2. Alexa Fluor 647鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probe ，目录号：A22287）
3. BCIP/NBT底物试剂盒（Vector Laboratories，目录号：SK-5400）
4. 1μg/ml用于核酸染色的DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）注意：在固定之前生长器官类的材料和设备（见小鼠肠干细胞的分离，培养和维持）
三（羟甲基）氨基甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
TWEEN 20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
Tris缓冲盐水（TBS）（参见Recipes）
10x PME缓冲区（请参阅配方）
IF缓冲区（参见配方）
阻止解决方案（参见配方）
渗透溶液（参见配方）

设备

台式多用途旋转器（Thermo Fisher Scientific，型号：2309）
配备白光激光器，Leica HyD检测器和Leica Application Suite软件的Leica Inverted Confocal SP8系统

软件

Leica应用程序套件

程序

将40μl含有类器物的基质胶加入1孔，每孔8孔室 - 载玻片。让孵化器硬化10-15分钟后，向孔中加入400μl培养基，至少每两天更换一次。如果通过EdU掺入来分析增殖，在固定前6小时向孔中加入10μMEdU
当准备固定，删除介质，加入300μl新鲜制备的4％PFA在PME缓冲液（室温）20分钟。对于这一步，并在整个协议，以更改在井中的解决方案，小心地将移液器吸头放入井的一侧，并提出解决方案。然后小心地添加新的解决方案在井的侧面。这在改变媒体时以相同的方式执行（O'Rourke等人，2016）。
取出固定液，用IF缓冲液洗一次。加入300微升渗透溶液到孔中透化20分钟
取出溶液，用IF Buffer洗涤一次，然后在室温下加入封闭溶液30分钟
备选步骤：通过碱性磷酸酶染色可视化肠细胞，用TBS洗涤固定的细胞两次，然后与300μl的BCIP/NBT底物试剂盒溶液在黑暗中孵育15分钟（按照试剂盒附带的指示，使BCIP/NBT溶液）。然后将室用TBS洗涤两次，然后使用明视野显微镜成像。一个例子如图2所示。

图2.显示强碱性磷酸酶活性（表明存在分化的肠细胞）的小肠组织样的明场图像。比例尺为50μm。
备选步骤：在一抗孵育前，可以使用试剂盒提供的指导，通过Click-It化学处理样品以进行EdU可视化。此时，请遵循 Invitrogen Protocol 步骤4.3，并以4.7结束。然后，如果需要，孵育你的样品在150微升的一抗在步骤7.对于一个EdU和角蛋白20染色的小肠类器官的例子，见图3.确保保护样品免受这一步的光。
准备一抗在封闭溶液，并添加150微升到每个孔。请参阅有关我们已验证的抗体的材料说明。让室 - 幻灯片在4℃下在大的湿润室中静置过夜。不要将腔室滑动盖留在腔室滑板上，因为它可能导致液体从腔室中拉出
孵育过夜后，用300μlIF缓冲液洗涤每个孔3次，每次5分钟。将室滑板放置在台式轨道摇床上，在每次洗涤期间设??定为60RPM。
在封闭液中制备二抗。对于我们已经验证的二次抗体的列表，参见注释4.将150μl溶液加入孔中，并在室温下放置1小时，以确保避光。任选地，可将鬼笔环肽缀合的荧光团加入到第二溶液中以显现F-肌动蛋白聚合物。
可选步骤：为了可视化DNA /核，制备DAPI（1μg/ml）在IF缓冲液中的溶液，并向每个孔中加入300μl5分钟。然后继续洗涤（步骤11）。
次级培养后，用步骤8中的300μlIF缓冲液洗涤每个孔3次
取出IF缓冲液，并使用拆卸试剂盒，随着腔室幻灯片分离腔室。
使用尖端切断的p200移液器吸头（见注6），在每个样品上加入少量ProLong Gold抗衰老封固剂（每个约20-30μl）。
将盖玻片放在样品上，避免气泡。使用清晰的指甲油密封玻璃盖玻片的两侧。让在室温下在黑暗中硬化过夜。成像后，载玻片可以在4℃下储存至少6个月，同时荧光损失最小

图3.显示增殖（EdU，红色），分化（Krt20，绿色）和细胞核（蓝色）的标志物的小肠组织样的免疫荧光图像。比例尺为50μm。

笔记

在洗涤过程中，您需要将液体吸入和排出腔室，同时小心避免类器官。具有锥形端的p1000移液管尖端可以有助于此
我们已经从Invitrogen的Click-iT Edu Alexa Fluor 647试剂盒获得了成功，但是请注意，该试剂盒提供多种荧光团，可用于防止与任何可能对您的细胞天然的荧光蛋白重叠。请注意，这个工具包还将销毁F-肌动蛋白，防止肌动蛋白细胞骨架的Phalloidin共轭荧光团，以及原生GFP的可视化。
我们验证了用于该测定的以下初级抗体：兔抗KRT20（1:200），兔抗溶菌酶（1:200），兔抗Muc2（1:200）和山羊抗绒毛蛋白（1： 200）。
我们已经验证了用于该测定的以下二抗：抗兔568（1:500），抗山羊594（1:500）和抗大鼠488（1:500）。
在固定和透化步骤之后，大部分Matrigel将会降解，使得类器物停留在孔的底部。这对于在固定之前在培养物中生长4-6天的小和大肠组织样品是真的，这可能是由于肠蛋白酶的产生。我们注意到，较短的培养时间或不同的器官类型细胞类型可以预防这种情况
当使用p200将吸附介质吸移到细胞上时，首先使用剪刀在锥形末端切割尖端以使其直径更大，这有助于移除溶液时避免气泡。
我们已经有使用共焦显微镜成像这些样品的最佳结果。具体来说，我们使用配备白光激光器，Leica HyD检测器和Leica Application Suite软件的Leica Inverted Confocal SP8。除了用于DAPI激发的405激光器和458,476,488,496和514nm的标准氩激光线之外，该设置允许将激发激光设置在470和670nm之间的任何波长。这意味着可以最佳地激发和干净地分离任何荧光团。 SP8还配备了门控技术，可显着消除自身荧光。
我们使用HC PL APO 20x .7NA IMM和HCX PL APO 40x 1.1NA物镜对这些样品进行成像。
关于使用该显微镜装置获得的免疫荧光图像的实例（参见图3）

食谱

Tris缓冲盐水（TBS）
25 mM Tris
0.15M NaCl
溶液的最终pH应为7.2至7.5
10x PME缓冲区
500 mM PIPES
25mM MgCl 2·h/v 50 mM EDTA
IF缓冲区
包含
的PBS
1. 0.2％Triton X-10
2. 0.05％吐温
封锁解决方案
IF缓冲区包含：
1％牛血清白蛋白（BSA）
渗透溶液
含有
的PBS 0.5％Triton X-100

致谢

我们感谢Lowe实验室的成员，以及Memorial Sloan Kettering癌症中心的分子细胞学核心设施，为您提供帮助。这项工作得到了来自NIH/NCI（CA-013106）的计划项目赠款的支持。 L.E.D。获得国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）海外生物医学奖学金和来自NCI/NIH（CA-181280-01）的K22职业发展奖。 K.P. O.得到NIH的国家综合医学科学研究所授予的医学科学家培训计划资助，授予T32GM07739授予Weill Cornell /洛克菲勒/Sloan-Kettering三机构MD-PhD计划。 S. W. L.是Geoffrey Beene癌症生物学主席和霍华德休斯医学研究所的研究员。

参考文献

Dow，L.E.，O'Rourke，K.P.，Simon，J.，Tschaharganeh，D.F.，van Es，J.H.，Clevers，H.and Lowe，S.W。（2015）。 Apc恢复促进细胞分化，恢复结肠直肠癌中的隐窝动态平衡。细胞 161（7）：1539-1552。
O'Rourke，K.P.，Ackerman，S.，Dow，L.E。和Lowe，S.W。（2016）。小鼠肠干细胞的分离，培养和维持生物协议 6（4）：e1733。