材料和试剂

保护玻璃（Corning，目录号：2998075X25）
48孔组织培养板（Corning，Falcon ，目录号：351178）
50ml和15ml锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352098和352097）。
10ml注射器（BD，目录号：309604）
21G针（BD，目录号：305165）
移液器提示
70μM细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
100μM细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352360）
为本协议收获的小鼠必须获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准用于赞助实验室研究的机构。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Invitrogen，目录号：10010023）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：10010023" />
生长因子减少基质胶（BD，目录号：356230）
注意：目前，"Corning，Matrigel ^? ，目录号：356230"
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16000-044）
胶原酶IV型（Worthington，目录号：LS004188）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
1％BSA-PBS（无菌）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
5mM EDTA-PBS
重组DNA酶I，无RNA酶（以10U /μl提供）（Sigma-Aldrich，目录号：4716728001）
任选：10μMRho激酶抑制剂Y-27632，以5mM溶液（Merck Millipore Corporation，目录号：68801）提供;
Advanced DMEM F/12（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12634-010）
链霉素（Gibco，目录号：15140-22）
N-乙酰半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
EGF 50ng/ml（Invitrogen，目录号：PMG8043）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：PMG8043" />
重组小鼠EGF 50ng/ml（Invitrogen，目录号：PMG8043）
重组小鼠头蛋白50ng/ml（Peprotech，目录号：250-38）
重组人R-Spondin 1,500ng/ml（R& D Systems，目录号：3474-RS-050）
重组小鼠Wnt-3A 100ng/ml（Merck Millipore Corporation，目录号：GF-160）
10mM烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N3376）
肠道基础培养基（见配方）
小肠组织生长培养基（见配方）
大肠组织生长培养基（见配方）

设备

移液器，移液器和微量移液器
解剖镊子和剪刀（Fine Science Tools，目录号：11150-10和14058-09）
离心机5810R（Eppendorf，型号：5810R）
明场倒置显微镜
台式辊在4℃室（Bibby Scientific Limited，Stuart Equipment，型号：SRT9D）中
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
生物安全柜（组织培养罩）
对于通过二氧化碳窒息的小鼠处死，必须根据实验室保荐机构批准的动物使用协议使用二氧化碳源，调节分配器和安乐死室。

程序

图1.从小鼠结肠或小肠中分离含有干细胞的肠道的关键步骤的概述

第I部分。小肠类器官的分离，培养，维持，传代和保存

分离和培养小肠类器官的步骤（预计完成时间：2-3小时）
1. 通过二氧化碳窒息将小鼠安乐死 ?2000年AVMA安乐死专家小组的报告（协会，2001）。
2. 解剖并去除15厘米的近端小肠。小心 ?避免接触任何鼠标皮肤或头发到您的工具，以防止微生物污染。解剖后，冲洗的内腔肠用冰冷PBS，使用10ml注射器和21G针。
3. 使用剪刀纵向打开肠，放在一个50 ml锥形管，含有25ml冰冷PBS。反转10-15次，取出PBS，并用25ml冰冷的PBS替换。重复此操作直到上清液不再含有任何可见的碎片
4. 将肠切成5毫米的块，放入10毫升冰冷的5mM EDTA-PBS。通过吸移大量研磨碎片上下放入10ml移液管15次。让片段沉淀重力30秒。
5. 吸出上清液，小心避免肠道碎片，并用10ml，5mM EDTA-PBS和 ?在4℃下在台式辊上放置10分钟
6. 重复步骤A5 ?吸出上清液，用10ml的5mM EDTA-PBS代替，但是现在在4℃在台式辊上放置30分钟
7. 吸气上清液，轻轻加入10 ml冷PBS洗涤隐窝和吸出。然后，加入10ml冷PBS，然后剧烈研磨 ?一个10ml移液管10次
8. 收集此10ml上清液部分在单独的管中。加入10毫升冷PBS的隐窝，剧烈研磨10次，然后收集该级分单独管。重复步骤A7一次，总共收集三次分数
9. 在显微镜下检查每个级分10μl，寻找完整的肠隐窝的存在和缺乏更大， ?碎片绒毛。从a。分离的完整的肠隐窝的一个例子 ?小鼠在Lgr5基因座处携带GFP敲入等位基因（Barker等人， al。，2007）如图2所示。
  
  图2. A 明场/epifluoresecent图像覆盖的新鲜孤立小在Lgr5-GFP敲入等位基因的肠隐窝（Barker等，，2007）。完整隐窝用白色箭头标记，包含Lgr5 + 干细胞由GFP（绿色）的存在标记。碎片（不可行细胞）由白色箭头标记。比例尺为50μm。
10. 使用含有最多隐窝的10ml部分，与10混合 ml基础培养基+ 15U/ml DNA酶I（加入30μl至10ml基础培养基）和通过100μm过滤器过滤到BSA（1％）包被的50ml锥形中管;涂覆管，加入1ml 1％BSA，剧烈摇动并弃去 ?过量。用BSA涂覆管防止隐窝的吸附管的侧面，因此增加产量
11. 过滤溶液再次，此时通过70μm过滤器进入BSA（1％）包被然后在台式离心机中以300×g离心滤液5分钟 ?min。
12. 吸出上清液。取决于多个因素（动物饮食，收获日的时间，每个洗涤步骤有多强 ?执行），可以有一层粘液积聚在上清液，有时靠近细胞沉淀。吸引这个意志增加您的产量的纯度，但它也可以拉细胞在真空吸入期间与其一起沉淀。小心避免失去你的在此步骤沉淀，可以使用10ml移液管轻轻地在此步骤吸出上清液。
13. 用含有5％FBS的5ml基础培养基重悬细胞沉淀，并以100×g离心5分钟。
14. 重悬细胞沉淀在200微升的基础培养基和计数隐窝 ?从10μl等分试样。你可能需要先稀释等分试样 ?计数以获得准确的数字。保持媒体的音量 ?你重新悬挂的地穴在尽可能低，因为你会瞄准将100-1,000个隐窝以1:10的混合物与Matrigel混合。在一个典型的分离，我们恢复250隐窝/μl（在基础培养基中）并混合1:10 与Matrigel。
15. 板40微升的Matrigel：crypt混合物作为泡在48孔板的一口井，小心避免让基质胶接触孔的边缘（对于示意图参见图3）。 ?虽然类器官仍将在Matrigel生长，已经"崩溃" 孔的侧面，如果matrigel更容易改变媒体保持作为在井的中心的单个泡。孵育平板 ?在37℃培养箱中，使基质胶聚合10-15分钟。
16. 每个添加250微升小肠组织生长培养基好。在7-10 d的过程中，活的肠干细胞应该形成具有隐窝 - 绒毛结构的类器官（例如，参见图 4）。
  
  图3.示意图说明了适当电镀的40μl 'matrigel bubble'在48孔板的一个孔的底部。250μl 的生长培养基在聚合反应后添加在气泡的顶部。确保基质胶不接触孔边缘允许a 移液管放置在井的侧面以移除介质媒体更改。
  
  图4.高分辨率明视场显微镜图片的小肠组织器，伴有示意图描述在所观察到的各个细胞类型结构体。比例尺为50μm。
保持，通过和低温保存小肠组织的程序
1. 分离后，每两天更换小肠生长培养基
2. 生长5-7天后，或当类器官显示黑暗，坏死核心，它们是传代的。为此，去除生长培养基将500μl冷PBS加入孔中，并将Matrigel分解移液管，小心避免在悬浮液中形成气泡混合物
3. 转移重悬浮到15毫升锥形管。使用 ?一个p200移液管，上下移液器50-100次，机械将类固醇分解为更小的片段。完成后，再向混合物中加入另外7ml冷PBS，用移液管吸取下降20次。
4. 在台式离心机中以200×g离心细胞5分钟。
5. 小心吸出上清液，小心不要除去颗粒。颗粒可能不是肉眼可见的，这是尤其是如果只传代1井真。重悬沉淀 Matrigel，并且每孔重复40μl到48孔板中。对于非转化器官培养物，我们通常以1:4的比例分裂
6. 如果准备储存在液氮中的细胞，重悬在含有10％FBS和10％DMSO的基础培养基中沉淀。允许冻结缓慢地在-80℃冰箱中，然后移至液氮中不定存储。

第二部分。分离，培养，维持，传代和低温保存大肠内器官

分离和培养大肠类器官的步骤（视频1）

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视频1. 分离和培养大肠道器官的步骤

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1. 小鼠按照AVMA安乐死面板2000年报告（Association，2001）的建议进行安乐死。
2. 解剖并去除近端大肠5-7厘米。是小心避免接触任何鼠标皮肤或头发到你的工具 ?防止微生物污染。解剖后，冲洗内腔肠用冷PBS。
3. 使用剪刀，打开冒号纵向。使用玻璃载片，轻轻刮擦管腔肠道清除粪便和粘液。放置在50ml圆锥形管用25ml冰冷PBS。倒转10-15次，取出PBS和用25ml冰冷的PBS替换。重复此过程，直到上清液不再含有任何可见的碎片
4. 切割肠5毫米，置于10ml冷5mM中 EDTA-PBS。通过向上和向下移液来强力研磨碎片移入10ml移液管15次。让片段通过重力沉降 30秒。
5. 吸出上清液，小心避免肠片段，并且用10ml，5mM EDTA-PBS替换并置于 ?4℃在台式辊上15分钟
6. 从中取出EDTA 管抽吸。用PBS洗涤2次。然后加入3ml的基础培养基含有500U/ml胶原酶IV型。吸移上下5次使用5ml移液管。置于37℃水浴中30分钟。
7. 加入10毫升冰冷的PBS，然后用10毫升吸管大力研磨10次
8. 在单独的管中收集该10ml上清液级分。加入10ml ?的冷PBS加入到隐窝中，剧烈研磨10次，然后将该级分收集在单独的管中。重复步骤B7一次共收集三个分数。
9. 吸移管各10μl 部分在载玻片上并在显微镜下检查，寻找完整的结肠隐窝的存在
10. 到10毫升含有最多隐窝的部分，加入10ml基础培养基 ?15U/ml DNA酶I（加入30μl至10ml基础培养基），然后过滤通过100μm过滤器进入BSA（1％）包被的50ml Falcon管。至包被管，移取1ml的1％BSA到管中并剧烈摇动。用BSA涂覆管防止了隐窝吸附到侧面 ?的管，因此增加产量
11. 过滤解决方案再次，这次通过70μm过滤器进入BSA（1％）包被管和然后在台式离心机中以300×g离心滤液5分钟
12. 吸出上清液。取决于多种因素（动物饮食，收获日的时间，每个洗涤步骤有多强执行），可以有一层粘液积聚在上清液，有时靠近细胞沉淀。吸引这个意志增加您的产量的纯度，但它也可以拉细胞在真空吸入期间与其一起沉淀。小心避免失去你的沉淀在这一步，可以尝试使用10毫升移液器与吸移助剂吸出上清液，或通过使用p1000 吸管。
13. 用含有5％FBS的5ml基础培养基重悬细胞沉淀，并以100×g离心5分钟。
14. 重悬细胞沉淀在200μl的基础培养基和计数隐窝 ?从10μl等分试样（例如，参见图5）。你可能需要首先稀释您计数的等分，以获得准确数。您想要保留重新悬挂的媒体的音量隐藏在尽可能低的地方，因为你会瞄准混合100-1,000 与基质胶1:10混合物的隐窝。在典型的隔离，我们会重悬50结肠隐窝/μl的基础培养基，并与1:10混合基质胶。
15. 将40μl重悬的混合物平板接种泡在48孔板的孔底部，小心避免让基质胶接触孔的边缘（见图3）。将板置于37℃培养箱中以允许基质胶聚合10-15分钟
16. 向每个孔中加入250μl大肠组织生长培养基。
  
  图5.来自200μl的10μl等分试样的明视场图像在第II部分的步骤A14中重悬结肠隐窝。比例尺为50μm。
保持，通过和低温保存结肠组织
这部分完全按照结肠类器官的描述进行，因为它是小肠类器官

笔记

我们通常测试2或3批Matrigel，并保留大量最好的性能。为了测试很多，我们将新鲜分离的干细胞涂布到基质胶中，并在两周后观察它们的生长，包括一次。
R-spondin1和Wnt3a产生细胞系可以从先前已经制备它们的研究者获得（Sato等人，2011），以便调节具有这些相应生长因子的培养基，大大降低了成本。 />
头蛋白通常以100ng/ml的终浓度加入到肠干细胞培养生长培养基中，但是我们发现50ng/ml足以支持正常的干细胞生长，分化和自我更新。
所有商业购买的生长因子可以溶解在0.1％BSA-PBS中，并在-20℃下作为浓缩储备溶液储存。
当准备胶原酶类型IV（结肠组织分离），在开始之前，做一个新的10x股票。粉末是静态的，因此将其称重在一片铝箔上并放置在15ml锥形管中，加入基础培养基以达到正确的浓度，并确保通过在37℃下涡旋或孵育使一切进入溶液。然后通过0.45μm过滤器过滤灭菌。
可以将10μMRho激酶抑制剂Y-27632加入到生长培养基中以增加类器官生长的产量，尽管我们常规地分离并生长没有该抑制剂的类器官。
分离后4-6天，结肠类器官应该开始生长为大空心球体，注意这比小肠干细胞生长通常观察到的更长。

食谱

肠道基础培养基
用
补充500 ml高级DMEM F/12瓶 2mM L-谷氨酰胺 100单位/ml青霉素，1,000μg/ml链霉素 1mM N-乙酰半胱氨酸 10 mM HEPES
小肠组织生长培养基
用
补充基础培养基重组小鼠EGF 50ng/ml
重组小鼠头蛋白50 ng/ml
重组人类R-Spondin-1 500ng/ml
大肠组织生长培养基
用
补充基础培养基重组鼠EGF 50ng/ml
重组鼠noggin 50 ng/ml
重组人类R-Spondin-1500ng/ml
重组鼠Wnt-3A 100ng/ml（Millipore GF-160）
10mM烟酰胺

致谢

该协议在Caroline Lindemans的帮助下改编自（Sato et al。，，2009）。这项工作得到了来自NIH/NCI（CA-013106）的计划项目赠款的支持。 L. E. D.得到国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）海外生物医学奖学金和NCL/NIH（CA 181280-01）的K22职业发展奖的支持。 K.P. O.得到NIH的国家综合医学科学研究所授予的医学科学家培训计划资助，授予T32GM07739授予Weill Cornell /洛克菲勒/Sloan-Kettering三机构MD-PhD计划。 S. W. L.是Geoffrey Beene癌症生物学主席和霍华德休斯医学研究所的研究员。

参考文献

Association，A.P.O。（2001）。 AVMA专家小组关于安乐死的2000年报告 J Am Vet Med Assoc 218（5）：669-696。
Barker，N.，van Es，JH，Kuipers，J.，Kujala，P.，van den Born，M.，Cozijnsen，M.，Haegebarth，A.，Korving，J.，Begthel，H.，Peters，PJ和Clevers，H。（2007）。通过标记基因Lgr5鉴定小肠和结肠中的干细胞。自然 449（7165）：1003-1007。
Sato，T.，Stange，DE，Ferrante，M.，Vries，RG，Van Es，JH，Van den Brink，S.，Van Houdt，WJ，Pronk，A.，Van Gorp，J.，Siersema， Clevers，H.（2011）。人结肠，腺瘤，腺癌和Barrett上皮的上皮组织的长期扩张。 a> Gastroenterology 141（5）：1762-1772。
Sato，T.，Vries，RG，Snippert，HJ，van de Wetering，M.，Barker，N.，Stange，DE，van Es，JH，Abo，A.，Kujala，P.，Peters，PJand Clevers， H.（2009）。单个Lgr5干细胞体外构建隐窝 - 绒毛结构，无间质利基。自然 459（7244）：262-265