材料和试剂

硼酸盐缓冲液BupH ^TM（Thermo Fisher scientific，目录号：28384）
离心圆底反应管（30ml）（Krackeler Scientific，COREX ，目录号：1-8445-30）
96孔板（透明的聚苯乙烯孔平底）（Sigma-Aldrich，目录号：M3687-60EA）。
微量离心管[2ml，带有盖的透明聚丙烯（PP）]（Sigma-Aldrich，Brand ，目录号：Z628034-500EA）
无菌培养管（PP）（14ml）（Lab Depot Inc.，目录号：TLDT8235）
使用Durapore PVDF膜UFC40VV25 Ultrafree（2ml）（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC40VV25）的离心过滤器（0.1μm孔径，非无菌）
铝箔
微量移液器（10μl，100μl和1,000μl）提示
绿脓杆菌（绿脓杆菌）PAO1野生型（菌株PAO0001）（http://www.pseudomonas.med.ecu.edu/）

氯仿（≥99％）（Carl Roth GmbH& Co.KG，目录号：3313.1）

乙酸乙酯（> 99.5％）（Merck Millipore Corporation，EMSURE ，目录号：1096231000）

盐酸（HCl）标准（1N溶液）（Sigma-Aldrich，Fluka analytical，目录号：318949-500ml）

HCl标准品（0.2N水溶液）（Sigma-Aldrich，Fluka analytical，目录号：343102-500ml）

Luria Bertani（LB）肉汤（Lennox）粉末微生物生长培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-250G）

亚甲基蓝溶液[在95％乙醇中的1.4％（w/v）]（Sigma-Aldrich，目录号：1808-50ml）

3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：M1254-100G）

鼠李糖脂（90％，标准）（Sigma-Aldrich，目录号：R90）

设备

微量移液器（100μl-1000μl）
微量移液器（10μl-100μl）
高压灭菌器
秒表
测量移液管（5ml）（Jaytec Glass Limited，目录号：WJ.485）
96孔微板分光光度计（例如Molecular Devices，型号：SpectraMax M2装置）
真空浓缩器（ Savant SPEEDVAC SVC 200H：200 x g ）
台式离心机
涡流搅拌器

程序

p。铜绿假单胞菌 PAO1培养和鼠李糖脂提取
1. p。铜绿假单胞菌PAO1在37℃下搅拌（175rpm）生长18小时在含有5ml LB-MOPS培养基的无菌培养管（14ml）中（培养物的初始A 600在0.020和0.025之间）。
2. 后 ?孵育，培养P 。离心（3200×g，24℃，5分钟），得到上清液和沉淀。 4 ?过滤上清液（0.1μm过滤器，20×g/g）以除去细胞。然后，使用，将无细胞上清液的pH调节至2.3±0.2 ?1N HCl（≈80μl）。
3. 通过混合4ml提取鼠李糖脂的上清液与4ml乙酸乙酯。不可混溶的混合物剧烈涡旋（600rpm）20秒，并进行相分离通过在台式离心机中以100×g /分钟的速度离心来实现 ?1分钟。
4. 上层含有鼠李糖脂的有机/乙酸乙酯将相转移到新的反应管（30ml）中。乙酸乙酯相应小心地移除，而不从顶部取任何液体 ?水层。
5. 提取程序重复三次和乙酸乙酯萃取液在反应管中合并在speedvac离心蒸发器（一般在200×g/min速度下在30分钟内蒸发）并立即定量。
鼠李糖脂定量
1. 氯仿 - 亚甲蓝复合物的形成
  干将鼠李糖脂提取物溶解在4ml氯仿中并与400混合 μl亚甲基蓝溶液（新鲜制备）。剧烈振动通过涡旋混合5分钟，然后在环境温度下温育 15分钟以允许颜色形成注意：氯仿相会 ?发展蓝色，与浓度成正比鼠李糖脂。覆盖管铝箔，以减少氯仿孵化期间的蒸发[图1（d）]。
  
  图1.预期结果在化学络合反应步骤。（a）。亚甲基蓝在含有100μg/ml鼠李糖脂（1）和氯仿的氯仿中的络合作用氯仿，没有鼠李糖脂（2）在T 5分钟。（b）。亚甲基蓝在含有100μg/ml鼠李糖脂（1）和氯仿的氯仿中的络合作用氯仿，没有鼠李糖脂（2）在T 10分钟。（C）。亚甲基蓝在含有100μg/ml鼠李糖脂（1）和氯仿的氯仿中的络合作用氯仿，没有鼠李糖脂（2）在T 15分钟。（d）。亚甲基蓝水溶液（MB）和含有100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml的氯仿 μg/ml，12.5μg/ml和0μg/ml的与亚甲基复合的鼠李糖脂蓝色。 T代表络合的孵育时间
2. 测量步骤
  将1ml氯仿（下）相转移到澄清的微量离心管（2ml），并通过用500涡旋20秒混合 μl的HCl 0.2N。然后通过离心进行相分离 ?台式离心机以速度100×g离心1分钟，并且溶液是在室温下放置10分钟以优化亚甲基蓝在HCl中萃取。最后，200μl的上部酸性相，含有 ?一部分络合的亚甲蓝，转移到96孔中 ?并使用SpectraMax M2在638nm测量吸光度 ?装置对抗HCl 0.2N空白
3. 鼠李糖脂校准曲线生成
  鼠李糖脂标准溶液通过将8mg的鼠李糖脂在4ml氯仿中的溶液。此解决方案用于生成通过在氯仿中稀释（即12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml）的不同浓度的鼠李糖脂。每个浓度，氯仿 - 亚甲蓝复合物的形成进行测量步骤以产生校准曲线方程（图2;表1）。

代表数据

图2.不同浓度的鼠李糖脂（12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml）的预期校准曲线。复合亚甲基蓝的吸光度在638nm下用SpectraMax M2装置针对HCl（0.2N）空白测量。复合和测量重复三次，误差条表示平均值的标准误差
表1.在638nm下用SpectraMax M2装置对HCl（0.2N）空白测量的络合亚甲基蓝的吸光度

之前通过比较分析结果和通常使用的蒽酮反应技术（Pinzon和Ju，2009）来验证亚甲基蓝鼠李糖脂方法的适用性。我们在表2中显示了这两种方法之间的主要区别，突出了亚甲基蓝鼠李糖脂方法的优点
表2.亚甲基蓝鼠李糖脂和蒽酮方法之间的比较表

笔记

氯仿相中蓝色显色的孵育时间对于每个测试样品应当相等
在氯仿相转移期间避免接触亚甲基蓝溶液（见视频1）。

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视频1.降低氯仿相转移和上部酸性相转移

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在上部酸性相转移期间避免移取氯仿，其将攻击/溶解96孔微板。为此，优选清洁的微量离心管或将氯仿/HCl溶液转移到透明管中以在移取上部酸性相之前更好地观察分离的相。在测量吸光度之前，检查所有孔都没有氯仿。
在所有转移阶段，为每个样本使用新提示。

食谱

LB-MOPS肉汤
将25g干LB粉末和10g MOPS加入到1,000ml去离子水中
通过加入NaOH溶液将pH调节至7.2±0.2 高压灭菌器
硼砂缓冲液
将一个硼酸盐缓冲剂溶解在500ml去离子水中（每个包装制备50mM硼酸盐，pH8.5）
储存在2-8°C
亚甲蓝水溶液
将200μl亚甲蓝溶液加入到4.8ml去离子水中
通过加入15μl50mM硼砂缓冲液将pH调节至8.6±0.2 在室温下贮存

致谢

该协议改编自以前发表的研究（Pinzon和Ju，2009）。这项工作得到了PIC-Madagascar项目2009年和ARES-CCD（比利时的Acédémiede Recherche et d'EnseignementSupérieur-CommissionCoopérationauDéveloppement）的博士后研究金方案"ELAN 2015"的支持。我们声明没有利益冲突。

参考文献

Chayabutra，C.，Wu，J.and Ju，L.K。（2001）。反硝化后由绿脓假单胞菌生产鼠李糖脂：限制营养物和碳的影响底物。 Biotechnol Bioeng 72（1）：25-33

Chandrasekaran，E.V.and BeMiller，J.N。（1980）。 In：Whistler，R.L。（ed）。碳水化合物化学方法。学术出版社，第89页

Helbert，J.R。和Brown，K.D。（1957）。蒽酮与单糖混合物和含有己糖醛酸的寡糖和多糖的显色反应。 em> Anal Chem 29：1464-1466。

Pinzon，N.M。和Ju，L.K。（2009）。通过亚甲基蓝络合作用分析鼠李糖脂生物表面活性剂。 Appl Microbiol Biotechnol < em> 82（5）：975-981。