材料和试剂

2ml Eppendorf管（VWR international，目录号：20170-170）
PIPETMAN Classic P1000移液管（Gilson Scientific Ltd.，目录号：F123602）
P1000移液枪吸头（VWR国际，目录号：83007-376）
1ml一次性注射器（BD，目录号：309659）
注射器过滤器，0.45μmPTFE膜（Pall Corporation，目录号：PN4543）
一次性过滤器单元（0.45μm）（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ^TM，目录号：166-0045）
螺纹色谱小瓶（VWR International，目录号：66009-858）
蓝藻属（Cyanobacterium）聚球藻属PCC 7002
液体培养（蓝细菌或其他微生物）
硫酸（H 2 SO 4）（Merck Millipore Corporation，目录号：SX1244）
琥珀酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：S3674）
α-酮戊二酸（Sigma-Aldrich，目录号：75890）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：338826）
丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：107360）
α-酮异己酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：68255）注意：在Sigma-Aldrich网站上也称为"4-甲基-2-氧代戊酸"。
8 mM H 2 SO 4子（参见配方）
50 mM琥珀酸盐储备溶液（见配方）
50 mMα-酮戊二酸储备液（见配方）
50 mM乙酸储备溶液（见配方）
50 mM丙酮酸储备溶液（见配方）
50 mMα-酮异己酸盐储备液（见配方）
10 mM有机酸标准混合物（见配方）

设备

微量离心机（Beckman Coulter，目录号：B30147）
Surveyor Plus HPLC（Thermo Fisher Scientific）由
组成
1. 测量仪液位泵
2. 测量员自动进样器（AS）
3. 测量器光电二极管阵列（PDA）Plus检测器
4. 测量仪折射率（RI）Plus检测器
5. Aminex发酵监测柱（150mm×7.8mm），静止 ?相聚苯乙烯 - 二乙烯基苯磺酸树脂，9μM颗粒大小，8％交联（Bio-Rad Laboratories，目录号：1250115）
6. 微保护阳离子H柱保护柱，30×4.6mm，氢气形式，pH范围1-3，对于Aminex型氢型柱（Bio-Rad 实验室，目录号：1250129）
ChromQuest?软件平台（Thermo Fisher Scientific，目录号：INQSOF012）

软件

Chromquest软件

程序

样品准备
1. 使用移液管，从液体培养基中取出2ml等分试样，放置 ?在2ml Eppendorf管中，并以13,000×g离心10分钟沉淀细胞
2. 取出并保留上清液，这是包含分泌的有机酸的胞外培养基。在此刻 ?可将上清液在-20℃冷冻用于以后的HPLC分析或立即分析，如以下步骤所述。
3. 过滤将500-700μl样品上清液加入到色谱小瓶中 ?ml一次性注射器和0.45μm孔径过滤器以除去可能干扰有机酸检测的颗粒潜在堵塞值和线。对每个有机物重复单独酸标准样品，用于构建标准曲线。盖住小瓶。现在可以进行HPLC分析了。
HPLC操作
1. 使用8mM H 2 SO 4作为用于等度洗脱的流动相。
2. 依次将柱温升至35℃，然后升至45℃ 使用Chromquest软件（使用0.1ml的流动相流速 min ^-1）。将折射率检测器设置为50°C。
3. 一旦柱已达到45°C下载一种测量样品的方法以下设置。这些设置是一个标准协议发酵监测柱，唯一的优化就是增加运行时间以确保样品已完全从柱中洗脱。
  1. Surveyor LC泵：总流量，0.5 ml/min;压力极限，0-1100 psi;运行时间，40分钟。
  2. Surveyor PDA Plus：运行时间，40分钟;扫描，200-360nm，扫描速率，1.0Hz;带宽1 nm。
  3. 测量员AS：注射体积，25μl;针头高度从底部，2.0 ?mm;注射器速度，8μlsec -1 -1 ;冲洗速度，70μlsec -1 -1 ;冲洗量， 500μl;洗涤体积，300μl;冲洗/洗涤源，8mM H 2 SO 4 4流动相; ?将托盘温度设置为10°C;启用柱温箱控制温度至45℃
  4. 测量员RI Plus：运行时间，40分钟;数据速率，10Hz;温度控制设置为50°C。
4. 等待10分钟使基线稳定，将小瓶放入自动进样器托盘，为您的运行创建新的序列文件，自动调零 PDA Plus和RI检测器，并启动运行。
数据分析
1. 由PDA Plus检测器产生的典型色谱图如图所示 ?图1. RI检测器产生类似的色谱图。的由不同菌株分泌的有机酸（图1A）可以通过将保留时间与已知标准的保留时间进行比较来鉴（图1B）。
2. 使用Chromquest软件对每个有机酸峰下的面积进行积分和量化
3. 通过绘制峰值为每个有机酸创建一个标准曲线面积对已知浓度。示例校准曲线如图所示 ?图2.
4. 使用标准曲线计算上清液样品中每种有机酸的浓度。这个将得到存在于细胞外的有机酸的浓度 ?媒体。数据可以归一化为细胞计数以确定量每个细胞分泌的有机酸。
图1. PDA检测器产生的HPLC色谱图。 A.来自野生型和ΔggC/C细胞的细胞外培养基。 B. 4mM有机酸标准品混合物。使用我们的实验程序，每种有机酸的保留时间如下：α-酮戊二酸盐，5.74分钟;丙酮酸盐，6.52分钟;琥珀酸酯，7.36分钟;乙酸乙酯，9.51分钟; α-酮异己酸盐，10.45分钟

图2.通过测量不同浓度的有机酸标准品的峰面积构建的示例校准曲线。 A.使用PDA检测器获得的校准曲线。 B.使用RI检测器获得的校准曲线

笔记

液体培养物必须具有足够的细胞密度以在胞外培养基中产生可检测浓度的有机酸。例如，以0.3g L -1的干重接种蓝细菌培养物，并且在干重0.3g L -1至2.0g L -1之间取样， sup> -1 。
PDA和RI检测器都将检测有机酸，因此来自任一检测器的色谱图可用于有机酸分析;然而，每个检测器具有特定的优点和缺点。 RI检测器通常是优选的，因为它们具有通用的检测能力并响应于分析物的整体性质，即其折射率。然而，RI检测器的一个限制是灵敏度的缺乏。 UV-Vis检测器（例如PDA）是受欢迎的，因为它们是简单，可靠和灵敏的检测器。然而，PDA检测器不能检测大多数醇，通常是共同分泌的代谢物
标准品可以单独运行（除了标准曲线混合物），以确定每种有机酸的比保留时间

食谱

8mM H 2 SO 4（pH 2） 0.898ml H 2 SO 4（98％）
将dH <2> O添加至1,000 ml
用0.45μm过滤器单元过滤
50 mM琥珀酸盐（储备溶液，冷冻保存）
14.76mg琥珀酸盐
将dH <2> O加到25ml
中
50 mMα-酮戊二酸（储备液，冷冻保存）
18.26mgα-酮戊二酸盐将dH <2> O加到25ml
中
50 mM乙酸（储备液，冷冻保存）
71.4μl乙酸
将dH <2> O加到25ml
中
50 mM丙酮酸（储备液，冷冻保存）
88.65μl丙酮酸（98％）将dH <2> O加到25ml
中
50mMα-酮异己酸盐（储备溶液，冷冻保存）
154.19μlα-酮异己酸盐（> 98％）
将dH <2> O加到25ml
中
10mM有机酸标准混合物（冷冻保存）
将上述5种50mM有机酸标准品各2ml混合，得到10mM混合有机酸溶液（最终体积10ml）。
对该混合有机酸溶液进行连续稀释以产生适于构建标准曲线的一系列浓度;例如5mM，2mM，1mM，0.5mM，0.25mM，0.1mM。标准曲线的浓度范围应该跨越在细胞外样品中测量的浓度

致谢

该协议改编自先前发表的研究（D'Adamo等人）（2014），并且由Davies等人（2014）和Jackson等人进行。 et al。（2015）。这项工作是由美国空军科学研究办公室（授予AFOSR 9550-14-1-0147）支持。

参考文献

Davies，F. K.，Work，V. H.，Beliaev，A.S。和Posewitz，M.C。（2014）。在野生型中工程苎烯和bisabolene产生和聚球藻属的糖原 - em> sp。 PCC 7002. Front Bioeng Biotechnol 2：21.
D'Adamo，S.，Jinkerson，R.E.，Boyd，E.S.，Brown，S.L.，Baxter，B.K.，Peters，J.W.and Posewitz，M.C。（2014）。稳定的氢化酶活性在嗜盐菌属Tetraselmis中的进化和生物技术影响。 PLoS One 9（1）：e85812。
Jackson，S.A.，Eaton-Rye，J.J.，Bryant，D.A.，Posewitz，M.C.and Davies，F.K.（2015）。聚球藻属的糖原 - 基因glgC突变体中的光合作用动力学。 Strain PCC 7002. Appl Appl Environ Microbiol 81（18）：6210-6222。