材料和试剂

5.0ml开顶聚合物超离心管（或能够进行高速离心的管）（Denville Scientific，目录号：U5022）
二乙胺（DEA）（≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：471216）
95％甲酸（FA）（AMRESCO，目录号：0961）
100mM NaCl（在室温下储存）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录数：BP152）
0.5M磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（AMRESCO，目录数：0348）
0.05％叠氮化钠（NaN 3）（Thermo Fisher Scientific，目录数：S2271）
250mM蔗糖（Thermo Fisher Scientific，目录数：S5）
0.5mM乙二胺四乙酸，二水合二钠（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，目录数：S311）
0.5mM乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma Aldrich，目录数：03777）
Tris-盐酸（Tris-HCl）
0.4％DEA在100mM NaCl中（参见配方）
0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）（参见配方）
甲酸中和缓冲液（参见配方）
组织匀浆缓冲液（THB）（参见配方）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）（参见Recipes）

设备

Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机（与SW50.1转子一起使用）
超声波超声波仪（见下面的注7）（Kontes，型号：KT50和目录号：12038）

程序

注意：以下方案已经用于从阿尔茨海默氏病的多种小鼠模型中提取Aβ[参见Cramer等人，（2012）和Casali et al。（2015）]。用户可能需要根据具体应用（例如ELISA和/或Western印迹）修改最终提取产物的稀释度。我们的实验室通常将AβELISA的DEA和FA级分稀释至少五倍，以符合我们内部ELISA检测限。对于Aβ和修饰的APP片段的蛋白质印迹，我们推荐每孔10至50微克蛋白质，并且关于使用DEA-可溶性提取物的Western印迹的更多细节，参见Morales-Corraliza等人。（2012）。

机械均质化
1. 机械均匀化脑组织（见注1）在850微升冷THB 缓冲液在冰上含有新鲜的蛋白酶抑制剂混合物。如果使用快速冷冻的大脑，立即匀浆。新鲜解剖的大脑也可以使用。均匀充分，使得均匀混合结果。
2. 等分250微升匀浆到1.5毫升 Eppendorf管在冰上进行DEA/FA提取（见注2）。继续 DEA/FA提取。如果没有立即提取，闪光冻结样品置于干冰上并储存于-80℃（注3）。
DEA/FAAβ提取
1. 向250μl匀浆中，加入250μl（注4）0.4％DEA并剧烈涡旋，直到混合物呈均匀。
2. 将500μl匀浆/DEA样品转移到能够进行高速离心的管中。
3. 使用旋转桶转子（注5），在4℃下，以135,000in x g 进行高速旋转1小时。
4. 取出425μl上清液，并用42.5μl0.5M Tris-HCl中和 ?（pH6.8）。涡流。分成220μl等分试样并快速冷冻干冰。储存于-80℃（注3）。将有剩余金额可溶性级分保留在具有不会沉淀的团粒的管中影响下游提取 - 仅除去425μl上清液
5. 使用从步骤B4剩余的匀浆沉淀，加入125μl冷甲酸（注6）。将管保持在冰上。
6. 每个样品在冰上超声1分钟连续输出之间振幅30-50（注7）。此后颗粒应溶解多少时间。如果没有，声波处理直到颗粒溶解
7. 在4℃下，以109,000 x g 进行另一次高速旋转1小时。
8. 取出105μl样品，加入1.895 ml甲酸中和 ?缓冲。涡旋，然后分成2×1ml等分试样并快速冷冻在干冰上。储存在-80°C（注3）。
  注意：对于预期收益率的DEA可溶性提取物和FA级分，我们的实验室常规获得 1.0至3.0mg/ml蛋白质和约0.1至0.5mg/ml 蛋白质。

笔记

我们的实验室使用一个大脑半球与小脑和中脑去除和快速冷冻在干冰上。我们的实验室在收获组织时不会清除脑膜
如果对脑组织匀浆进行其它测定，则将剩余的匀浆相应地分装以用于下游应用（例如：Western印迹; RNA提取; 等）。
在正常工作的冰箱中储存在-80°C，样品储存在密封管中，我们的实验室常规使用收集后6个月的样品。
加入匀浆中的DEA的量为1:1（体积/体积）
使用摆动桶或滑架对于进行有效的提取至关重要。
甲酸必须是冷的（即，冷却至至少4℃）以沉淀不溶性蛋白质。
我们的实验室使用Kontes微超声波（20 KHz频率）细胞破碎器，额定功率为50瓦，120伏和2安培。

食谱

0.4％DEA溶液
200μlDEA
1ml 5M NaCl
ddH 2 O至50ml
储存在室温下，并在3个月内使用
甲酸中和缓冲液
1 M Tris碱
0.5M Na 2 HPO 4
0.05％NaN 3> / 储存在室温下，并在3个月内使用
组织匀浆缓冲液（THB）
2mM Tris（pH7.4） 250mM蔗糖 0.5mM EDTA 0.5mM EGTA 适量无RNase的H 2 O 2/b 储存在4°C，并在3个月内使用
注意："q.s."表示"需要数量"。
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
39.4克三盐酸盐适量ddH sub 2 O
将pH调节至6.8
储存在室温下，并在三个月内使用
蛋白酶抑制剂混合物
使用1：100稀释，并使每个均质化（如果您所需的下游应用程序检查磷酸化蛋白，除蛋白酶抑制剂鸡尾酒之外添加磷酸酶抑制剂）新鲜。

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院R41-AG048658的资助。

参考文献

Casali，B.T.，Corona，A.W.，Mariani，M.M.，Karlo，J.C.，Ghosal，K.and Landreth，G.E。（2015）。 Omega-3脂肪酸增强了核受体激动剂在阿尔茨海默病小鼠模型中的作用。/a> J Neurosci 35（24）：9173-9181。
这些结果表明，在一个实施方案中，本发明的方法可以用于制备本发明的化合物，所述化合物包括但不限于下列化合物：Cramer，PE，Cirrito，JR，Wesson，DW，Lee，CY，Karlo，JC，Zinn，AE，Casali，BT，Restivo，JL，Goebel，WD，James，MJ，Brunden，KR，Wilson，DAand Landreth， GE（2012年）。 ApoE指导的治疗可快速清除AD小鼠模型中的β-淀粉样蛋白和反向缺陷。科学 335（6075）：1503-1506。
Morales-Corraliza，J.，Berger，J.D.，Mazzella，M.J.，Veeranna，Neubert，T.A.，Ghiso，J.，Rao，M.V.，Staufenbiel，M.，Nixon，R.A.and Mathews，P.M。 Calpastatin调节β淀粉样蛋白沉积大脑中的APP加工，但不调控野??生型小鼠。 a> Neurobiol Aging 33（6）：1125 e1129-1118。