材料和试剂

玻璃幻灯片（超级霜）（Matsunami玻璃）
注意：可以使用适合于荧光观察的任何类型的载玻片。我们在载玻片上贴上黑色胶带，用盖玻片包住样品（见图1D）。
盖滑（24×60 No.1，厚度0.12-0.17mm）（Matsunami玻璃）
10ml一次性注射器（Terumo Medical Corporation）
表达过氧化物酶体靶向GFP（GFP-PTS1）的拟南芥（Columbia生态型）（Mano等人，2002）
注意：1-4如图1A所示。
含有维生素，1％蔗糖和MES缓冲液（pH5.7）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：341-5）的1/3 x Murashige和Skoog盐（MS）培养基（Wako Pure Chemical Industries，目录号：392-00591） 01622）
用于植物生长的琼脂粉（Funakoshi，目录号：BA-10）
蒸馏水
KOH
植物培养基（见配方）

设备

剪刀和镊子（如图1A所示）
40x干系统物镜（ZEISS，EC Plan-Neofluar ）
用于生长植物的生长室（100μmol.m-2 s -1白光照明16h和黑暗8h，22℃）
暗盒黑盒
共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：LSM510 META）

软件

NIH ImageJ软件1.46（ http://imagej.nih.gov/ij ）
注意：ImageJ也可在Mac OS X，Windows和Linux上使用。

程序

叶区的准备
1. 切割3周龄拟南芥植物的玫瑰花叶，直径1厘米，并置于充满水的注射器（图1B）。
2. 用手指插入注射器的顶部，并拉动柱塞使叶子脱气（图1B）。
3. 将一片脱气叶片部分（图1C）装在载玻片上，并用盖玻片覆盖（图1D）。
4. 在黑暗或光照下在生长室中孵育预处理的叶样品2小时
图1. CLSM观测的叶片部分的制备。 A。所有仪器用于制备叶片。 B.通过在插入注射器的顶部的同时拉动柱塞来使叶子脱气。 C.用于观察的叶片。前（左）和后（右）脱气。 D.安装在载玻片上的除叶片部分。
通过CLSM采取细胞器图像
1. 叶栅叶肉细胞中的细胞器的图像被聚焦并通过使用LSM 510的40x干系统物镜获得（图4）。
2. 为了观察GFP荧光，使用488nm Ar/Kr激光，通过发射滤光片BP505-550检测荧光。检测 ?使用来自叶绿素的自发荧光，543nm He/Ne激光器 ?通过发射滤波器LP580获取信号。
3. 同时获得两个荧光并将数据保存为tif的单个图像。文件。
  注意：在从生长室移动样品后30分钟内，细胞器的观察应该完成，因为光条件的改变影响细胞器的运动和相互作用。
细胞器相互作用的量化
1. 启动Image J软件并打开获取的图像。
2. 设置s的比例：Analyze>设置缩放
3. 设置测量：分析>设置测量>检查Shape描述符的列（图2）。
  
  图2.图像J的分析菜单用于测量线段的长度。在"设置测量"窗口中选择"形状描述符"。结果：10 相互作用长度作为计算的实例示出选择分析菜单下的测量模式。
4. 使用线工具，绘制连接两个细胞器之间的两个交叉点的线，或使用线段工具，绘制曲线（图3的右图中的红线和图4的下图）用于测量。注意：绘制线条时，图像通过放大（放大）功能放大。图像>缩放>在{+}。
  
  数字 ?3.图像J的分段线工具用于测量过氧化物酶体和叶绿体之间的相互作用长度（右图中的红线）
5. 测量线的长度：分析>测量
  注意：应当测量过氧化物酶体和叶绿体之间的至少50个相互作用的平均值，以计算独立的三次实验中的平均长度（图4，表1）。在这里，我们显示十个样品的结果，用于测量过氧化物酶体和叶绿体之间的相互作用长度
  
  图4.黑暗（左图）和浅色（右图）的过氧化物酶体（绿色）和叶绿体（洋红色）之间的膜接触面积的10个选择的相互作用长度的测量。它们的形状对光的伸长，提示它们的光的生理相互作用增强。上图是原始图像。条=10μm
  
  表1.在黑暗和光照下过氧化物酶体和叶绿体之间的10个选择接触长度的测量结果。在光照条件下的接触长度比在黑暗条件下的接触长度长。这一事实表明，过氧化物酶体通过在光合作用中与叶绿体紧密接触来协助光呼吸。

食谱

植物培养基
在1L纯水中溶解10g蔗糖，1.53g MS盐和0.5g MES，然后用1M KOH将pH调节至5.7 / 在培养基中加入8g琼脂，然后高压灭菌

致谢

这项工作得到教育，文化，体育，科学和技术部（MEXT）[KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas to M.N。（No. 22120007）和Y. H.（No. 22120010）]的支持。

参考文献

Mano，S.，Nakamori，C.，Hayashi，M.，Kato，A.，Kondo，M。和Nishimura，M。（2002）。通过用GFP可视化的拟南芥中过氧化物酶体的分布和表征：动态形态和肌动蛋白依赖性运动。/a> Plant Cell Physiol 43（3）：331-341。
Hosokawa，Y.，Iino，T.，Oikawa，K.，Mano，S.，Yamada，K.and Nishimura，M。，< a class ="ke-insertfile"href ="http：通过飞秒激光技术定量测定过氧化物酶体和叶绿体之间的粘附强度。生物方案 6（11）：e1834 br />
Oikawa，K.，Matsunaga，S.，Man，S.，Kondo，M.，Yamada，K.，Hayashi，M.，Kagawa，T.，Kadota，A.，Sakamoto，W.，Higashi， Watanabe，M.，Mitsui，T.，Shigemasa，A.，Iino，T.，Hosokawa，Y.and Nishimura，M.（2015）。原位激光分析所阐明的过氧化物酶体和叶绿体之间的物理相互作用。 em> Nat Plants 1：15035.
Shibata，M.，Oikawa，K.，Mano，S.and Nishimura，M.（2014）。过氧化物酶体的数量测量生物协议 4（21）：e1284。