材料和试剂

材料
1. 96孔微量滴定板（Corning，目录号：3595）
2. 多通道移液器（Gilson，型号：D10，D200和D1000）的提示
3. 离心管（SARSTEDT AG& Co，目录号：72.690）
试剂
1. 病毒抗原
  注意：病毒在含胚卵中扩增 Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。请参阅手册实验室诊断和流感病毒学监测，WHO。
  1. H1N1
    A/Ohio/83
    A/Solomon Islands/2006
    A/Ohio/07/2009
    A/Texas/05/2009-RG15
    A/Texas/18/2009-RG18
    A/California/04/2009
  2. H2N2
    A/Ann Arbor/6/60 ca
  3. H5N1
    A/Vietnam/1203/04（VNH5N1-PR8/CDC-RG）
    A/Anhui/01/2005（H5N1）-PR-IBCDC-RG6
  4. H9N2
    A/ck/HK/G9/97（H9N2）/PR8-IBCDC-2
    A/Green-winged teal/209/TX/2009
  5. H3N2
    A/Hong Kong/68
    A/Philippines/2/1982
    A/Beijing/353/89-X109-H3N2 PR8重配体
    A/Beijing/32/92-R-H3N2 PR8重配体
    A/Johannesburg/33/94 R-H3N2 PR8重配体
    A /南昌/933/95
    A/Sydney/5/97
    A/Panama/2007/99
    A/Wyoming/3/03.rg
    A/Brisbane/10/07
  6. H7N2
    A/turkey/Virginia/2002（H7N2）/PR8-IBCDC-5
  7. H7N9
    A/Anhui/1/2013
    A/Shanghai/2/2013
2. 单元格
  Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞（ATCC，目录号：CCL-34）
3. 中和抗体
  来自感染了A（H1N1）pdm09的恢复期患者的人单克隆抗体CT149（Celltrion INC。，South Korea）
4. 媒体
  1. DMEM（Invitrogen，目录号：11965-092）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco™，目录号：11965-092"。
  2. 胎牛血清（FBS）（VWR International，HycloneTM ^{，目录号：SH30070.03）}
  3. 青霉素 - 链霉素（Invitrogen，目录号：15140-122）注意：目前，它是（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140-122）"。
  4. L-谷氨酰胺，200mM溶液（Invitrogen，目录号：25030-081）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030-081"。
  5. 牛血清白蛋白（BSA）（级分V，无蛋白酶）（Roche Diagnostics，目录号：03117332001）
  6. HEPES，1M缓冲溶液（Invitrogen，目录号：15630-080）注意：目前，它是（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630-080）"。
5. 其他试剂
  一个。 ELISA抗体
  1. 一抗[抗核蛋白（NP）抗体]，小鼠抗流感A抗体（Merck Millipore Corporation，目录号： MAB8257）和抗流感A抗体（Merck Millipore Corporation，目录号：MAB8258）
  2. 二抗，山羊抗小鼠IgG 缀合于辣根过氧化物酶（HRP）（Kirkegaard& Perry Laboratories，Inc.，目录号：074-1802）
  b。磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：14190）
  C。 Tween-20（Merck Millipore Corporation，目录号：8.17072） d。抗体稀释剂（Teknova，目录号：D5120）
  e。丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：270725）
  F。 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（Sigma-Aldrich，目录号：T0440）
  G。停止溶液（Merck Millipore Corporation，目录号：109072）
  注意：在默克密理博公司网站上命名为"硫酸"。
6. 洗涤缓冲液（见配方）
7. MDCK介质（参见配方）
8. 病毒稀释培养基（见配方）

设备

血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1492）
多通道移液器（Gilson，型号：PIPETMAN Neo ^？多通道）
培养箱，37℃，5％CO 2（Panasonic Corporation，Sanyo Electronics company，型号：MCO-170AIC-PE）
SpectraMax M5多检测酶标仪系统（Molecular Devices，型号：M5）

程序

使用病毒稀释液制备初始单克隆抗体稀释液
向第1列到第10列的所有孔中加入50μl病毒稀释液。
加入50微升的单克隆抗体（1毫克/毫升储备溶液）到第一个井，并使用多通道移液器从第一个孔转移50微升2倍系列稀释液到每个连续的井从1：1到1 ：128。参见图1.
最后稀释后弃去50μl。

图1. MN测定的测试样品的系列稀释向第1至10列的所有孔中加入50μl病毒稀释液，并将50μl样品加入第一个孔中，制备2倍连续稀释通过转移50微升使用多通道移液器。样品的稀释因子为1至128.
覆盖并保持在37℃，5％CO 2培养箱中，同时制备稀释的病毒。至关重要的是保持适当的pH，以便在添加时对病毒没有有害的pH影响。
将病毒稀释液中的病毒稀释至正确的工作稀释度，为100 TCID 50 /50μl（TCID 50：50％组织培养感染剂量，100TCID 50：100×TCID ₅₀）。
加入50μl稀释的病毒到含有抗体和病毒对照（VC）孔（A12，B12，C12和D12）的孔，并且不添加病毒到细胞对照（CC）孔（E12，F12，G12和H12）不要为病毒回滴定保留的孔列添加病毒
图2显示了测试抗体的系列稀释和回滴定的详细图

图2.抗体的系列稀释和反滴定。测试样品（绿色框）和病毒反滴定（黄色框）的系列稀释液用50μl+ 50μl稀释2倍。病毒对照（蓝色框）也是50微升+ 50微升，但细胞控制（红框）只有100微升的稀释剂。
轻轻轻拍以混合。
向CC孔中加入100μl病毒稀释液。
向VC孔中加入50μl病毒稀释液。
在每个测定中，包括对病毒的工作稀释的反滴定，因为中和抗体滴度敏感地改变取决于病毒滴度。
向第11列的所有孔中加入50μl病毒稀释液。
加入50μl病毒的工作稀释液到第一口井，并使用多通道移液器从第一口井转移50μl，通过井12每个连续的井，进行2倍系列稀释。
弃去孔12中的50μl。
向所有孔中再加入50μl病毒稀释液，总体积为100μl
盖上并在37℃，5％CO 2孵育1小时
1小时后，向微量滴定板的每个孔中加入100μl稀释的MDCK细胞（其应当是70-95％单层，低通量<30）。每个孔含有1.5×10 4个细胞。
在37℃，5％CO 2孵育18-20小时
孵育后，从微量滴定板中取出培养基，用200μlPBS洗涤板，然后除去PBS（用手翻转板，溢出PBS，然后用纸巾交换剩余的液体）。
加入100微升80％冷丙酮到每个孔，孵育在室温（RT）10-12分钟，以便在ELISA之前固定。
取出丙酮（用手翻转板，溢出丙酮，然后用纸巾交换剩余的液体），让板空气干燥10分钟或直到干燥。
稀释抗体稀释液中的一抗以达到最佳工作稀释
用300μl洗涤缓冲液洗板3次，加入100μl稀释的一抗（1：1,000）
盖上并在室温下孵育1小时
稀释抗体稀释液中的第二抗体至最佳工作稀释度
用300μl洗涤缓冲液洗板3次，加入100μl稀释的二抗（1：2,000）
盖上并在室温下孵育1小时
用300μl洗涤缓冲液洗板5x，加入100μl新鲜制备的TMB底物。
在RT孵育，直到VC孔中的颜色变化剧烈，并且CC孔中的相应颜色变化最小。
加入100μl终止液
使用微量滴定板分光光度计在490nm处读取孔的吸光度（O.D.）
外径在VC孔中应该至少为0.8，通常在1.0-1.5的范围内，尽管更高是可以接受的
外径在CC井中必须≤0.2。
数据分析如下。
1. 评估以确定是否使用的病毒的工作稀释测定含有所需量的病毒。截止值病毒回滴定是VC中值和CC中值的平均值。这与用于计算中和的截止值相同抗体滴度。第一孔的稀释度低于截止值是反滴定滴度。在反滴定孔中的稀释液以井A：1：1,1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64,1：128开始。在一般，滴定滴定度为16,32和64是可以接受的
  回滴定示例
  中间O.D.的CC = 0.2
  中间O.D.的VC = 1.0
  VC中值和CC中值的平均值=（0.2 + 1.0）/2 = 0.6 =截止值
  O.D.的回滴定孔（表1）
  
  表1. O.D.的回滴定孔
  
  稀释
  1：1
  1：2
  1：4
  1：8
  1:16
  1:32
  1:64
  1：128
  
  O.D.
  2
  1.5
  1
  0.8
  0.5
  0.4
  0.3
  0.2
  
  1:16（O.D.:0.5）是低于临界值（O.D. 0.6）的第一口井回滴定滴度为1:16。
2. 通过计算中和抗体滴度来确定中和抗体滴度截断值以确定每个的50％中和抗体滴度基于等式：（VC的中值O.D. + CC的中值O.D.）/2 = X，其中X = 50％截止值。所有低于或等于X的值为阳性的中和。阅读每个含有稀释的柱子抗体从底部开始，从孔H开始。注意第一个孔小于50％截止值的OD。互逆抗体稀释对应于该孔是50％中和抗体滴度该抗体样品
  中和抗体滴度的例子
  中间O.D. 的CC = 0.2
  中间O.D. 的VC = 1.0
  VC中值和CC中值的平均值=（0.2 + 1.0）/2 = 0.6 =截止值
  O.D. 的回滴定孔（表2）
  
  表2. O.D. 的中和抗体孔
  
  稀释
  1：1
  1：2
  1：4
  1：8
  1:16
  1:32
  1:64
  1：128
  
  O.D.
  0.1
  0.2
  0.3
  0.4
  0.5
  0.8
  1.5
  2.0
  
  1：4（O.D .: 0.5）是低于50％截止值（O.D. 0.6）的第一口井。
  中和抗体滴度为1:16。

食谱

洗涤缓冲液
具有0.3％Tween20的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
MDCK介质
DMEM补充有
10％胎牛血清（FBS）
100 U/ml青霉素
100mg/ml链霉素 2mM l-谷氨酰胺过滤灭菌
病毒稀释液
DMEM，补充有1％牛血清白蛋白（BSA）（级分V，无蛋白酶）（制备为在dH 2 O中的10％w/v溶液，过滤灭菌， °C）
100 U/ml青霉素
100mg/ml链霉素 20 mM HEPES
为每个测定准备新鲜的
过滤灭菌

致谢

我们感谢Jun Myung Kim博士和Sang Hoon Han博士提供Severance医院的血液样本，SC World公司的Yasuo Watanabe博士为抗体筛选的ISAAC分析提供帮助。本研究得到韩国卫生和福利部韩国医疗保健技术研究与发展项目的资助。（国家自然科学基金资助项目（编号A103001），国家自然科学基金（NSFC，编号81401671），中国科学院战略重点研究计划（编号XDB08020100），中国国家大科技（授权号2015ZX09304005），GFG是NSFC创新研究组（授权号81321063）的首席主要研究员。本报告的结果和结论是作者的结果和结论，不一定代表疾病控制和预防中心或有毒物质和疾病登记处机构的观点。

参考文献

Klimov，A.，Balish，A.，Veguilla，V.，Sun，H.，Schiffer，J.，Lu，X.，Katz，J.M.and Hancock，K。（2012）。流感病毒滴定，抗原表征和抗体检测的血清学方法。 Methods Mol Biol 865：25-51。
实验室诊断和流感病毒学监测手册世卫组织全球流感监测网络。