材料和试剂

50ml Falcon管
Greiner CELLSTAR ，96孔圆底组织培养板（Sigma-Aldrich，目录号：M9311）
24孔和48孔组织培养板（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3524和CLS3548）的孔中。
10ml管
小瓶
外周血
EBV转化的B细胞系（HLA-A2）
Ficoll（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）
磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Lonza，目录号：17-512F）
台盼蓝溶液（0.4％）（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
RPMI 1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
合成肽（Purar Chemicals）
流感基质肽58-66（MP 58-66; GILGFVFTL）（GL-Biochem）
5％汇集的人血清
细胞因子IL-2（Peprotech，目录号：AF-200-02），IL-15（Peprotech，目录号：AF-200-15）
人IFNγELISA试剂盒（BioLegend，目录号：430106）
Miltenyi IFN-γ分泌测定试剂盒-PE（Miltenyi Biotec，目录号：130-054-202）
CD8-FITC（SK1）mAb（克隆SK1）（Thermo Fisher Scientific，eBiosciences ^TM，目录号：11-0087-42）
Fungizone（Thermo Fisher Scientific，目录号：15290-018）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：81845）
佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
HEPES（1M）（Life technologies，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15630-080"
非必需氨基酸（NEAA）（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：11140-050）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11140-050"
GlutaMAX ^TM（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：35050-061）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：35050-061"
UltraPure TM 0.5M EDTA，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-020）}
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
细胞因子和肽的储备浓度（参见配方）
细胞培养基（参见配方）
染色缓冲液（见配方）
碘化丙啶（PI）的储备浓度（见配方）
PMA和离子霉素的储备浓度（参见配方）
除草剂的浓度（见配方）

设备

Megafuge 40R离心机（ThermoFisher，目录号：75004503）
Neubauer
冷冻容器，Nalgene ^® Mr. Frosty先生（Sigma-Aldrich，C1562）
细胞培养CO 2培养箱（Panasonic Healthcare Co.，型号：MCO-20AIC），具有5％CO 2
流式细胞仪（BD Biosciences，型号：BD FACSAria III）
液氮杜瓦

程序

从HLA * A02：01阳性供体收集约25ml的血液。通过在10ml Ficoll（20℃，805×g，无制动）上离心制备外周血单核细胞（PBMC）。从上面的Ficoll收集PBMC和在DPBS中洗涤两次。使用台盼蓝排除在Neubauer腔上计数活PBMC。在补充有5％汇集的人血清的RPMI 1640中将PBMC稀释至2×10 6个细胞/ml。将总共6.0ml的细胞悬浮液（12×10 6个细胞）用于肽刺激。用1μM流感基质肽58-66（MP 58-66 GILGFVFTL）在RPMI中培养PBMC（在37℃，5％CO 2下）3天1640，补充有5％汇集的人血清[The Australian Red Cross Blood Service（ARBCS），Melbourne，Australia]。以5×10 6个细胞/瓶冷冻剩余的PBMC，并储存在液氮中，以供稍后在再刺激和筛选步骤中作为抗原呈递细胞（APC）使用（步骤3）。
注意：
1. 选择具有针对肽抗原的合适HLA I类等位基因的供体。
2. 可以使用其他血清，例如胎牛血清。我们优选使用人血清，因为这导致在没有肽的情况下较低的背景响应
三天后，向细胞中加入IL-2（终浓度为20U/ml）和IL-15（终浓度为5ng/ml）。继续培养另外7天，使总培养时间为10天。
通过表面捕获染色，在用肽（1μM终浓度）和解冻的，自体的，辐射的（60Gy）PBMC（来自上述步骤1）的过夜再刺激后检测分泌IFNγ的CD8 +细胞。 IFNγ分泌和捕获根据 Miltenyi的说明。自体的，辐射的PBMC与PBMC培养物与肽和细胞因子以1:1的比例使用。在37℃/5％CO 2下培养1小时后，向每个管中加入2ml冰冷染色缓冲液，将细胞在515×g下洗涤5次，每次5分钟min。将洗涤的细胞用90μl染色缓冲液和10μlIFNγ捕获试剂重悬，并在冰上孵育5分钟。然后将细胞转移至50ml Falcon管中，加入温热（37℃）培养基以将细胞稀释至1×10 5个细胞/ml。然后将稀释的细胞在37℃/5％CO 2下孵育60分钟，偶尔混合。平行地，在不存在肽的情况下，细胞的小样本（〜0.5×10 6个）被"再刺激"。捕获1小时后，使用PE标记的检测mAb检测IFNγ。对于IFNγ检测，将细胞在冰冷的染色缓冲液中稀释，并在4℃下以515×g离心5分钟。将细胞重悬于90μl染色缓冲液中达5×10 6个细胞。为了染色，加入10μlIFNγ检测抗体和10μlCD8-FITC以染色CD8。将管在冰上孵育10分钟，然后将细胞用冰冷的染色缓冲液洗涤一次，并转移至FACS管进行分选。
sup> + 单元格存在，没有重新刺激。在用肽再刺激后，我们预期IFNγ⁺ 细胞数量增加> 5倍。
流式细胞术。使用单色染色样品测定补偿设置。加入碘化丙啶（终浓度为1μg/ml）以排除死细胞。阴性对照样品（无肽）和阳性对照样品（PMA /离子霉素刺激）可用于设置分选门。使用FSC-w（前向散射宽度）vs FSC-h（前向散射高度）门（图1）排除双峰。将单个CD8 +细胞，IFNγ+细胞分选到含有饲养细胞的96孔板的60个内孔中（照射（60Gy）] PBMC，抗CD3 （Mannering等人，（2003））中所描述的（OKT3,30ng/ml）和IL-2（20U/ml）和IL-15（5ng/ml） br /> 注意：

我们不喜欢使用96孔板的外孔，因为这些孔常常被真菌感染。
常规地在培养物中包含菌丝体（终浓度2.5μg/ml）。这显着降低了板中的真菌污染率。

培养含有分选的IFNγ+，CD8 +细胞，辐照的饲养细胞，细胞因子，抗CD3和真菌的平板（37℃/5％CO 2 ）。一星期后，将含有60U/ml IL-2和15ng/ml IL-15的50μl培养基加入96孔圆底板的每个孔中。这使得终浓度为20U/ml的IL-2和5ng/ml的IL-15 在培养另一周后，在50μl培养基中用IL-2和IL-15再次"喂养"每个孔。这使每个孔的最终体积为200μl。
在分拣后〜14天，生长的克隆应该开始变得在一些孔中可见注意：

此时被辐照的饲养细胞应该死了。
最好使用倒置显微镜识别生长克隆。
最方便的是使用毡尖笔在生长克隆的孔上方的板的盖子上放置一个圆圈。

将生长的克隆转移到48孔板。加入另外200μl含有IL-2（40U/ml）和IL-15（10ng/ml）的培养基，使终浓度为20U/ml IL-2和5ng/ml IL-15最终体积为400μl

通过ELISA测定测试克隆的抗原特异性抗原特异性测试在具有HLA-A2 + APC和肽的两个孔中以及具有APC但没有肽的两个孔中进行。将48孔板中的每个克隆重悬于〜400μl。一至二百微升的该细胞悬浮液转移到10ml试管中，在10ml DPBS中洗涤，然后用1.0ml培养基洗涤。对于ELISA测定，将洗涤的克隆重悬于400μl培养基中，并将100μl分配到含有APC（50,000个EBV转化的B细胞/孔）的96孔圆底板的四个孔中，其中（两个孔）和两孔）肽（1.0μM）。过夜培养后收集100μl上清液并通过ELISA测定IFNγ（ http://www.biolegend.com/human-ifn-gamma-elisa-max-standard-2226.html ）。
注意：

我们常规使用表达所需HLA分子（在这种情况下为HLA-A2）的EBV转化的B细胞系。也可以使用可选的APC，例如辐射的PBMC（60Gy）或转染的细胞系。
其他测定，例如 ^{Cr发布，也可用于筛选克隆。我们优选使用IFNγ分泌作为初始筛选，因为所有应答细胞应该分泌这种细胞因子，因为它们是基于IFNγ分泌选择的。}
通过用抗CD3（OKT3）再刺激， IL-2和IL-4，如Ciantar和Mannering（2011）中所述

扩增后，重新测试克隆的抗原特异性并储存在液体中氮气直至需要。为了冷冻它们离心的克隆（515×g，5分钟，室温）。在倒出上清液之后，将细胞重悬于FCS中（通常至10×10 6个细胞/ml）。缓慢加入等体积的含有20％DMSO的FCS，同时轻轻混合。将1.0ml（〜5×10 6个细胞/小瓶）的等分试样分配在适于在液氮中冷冻的小瓶中。将小瓶置于含有丙醇的冷冻容器中，并在-80℃冷冻箱中贮存过夜。第二天将小瓶转移到液氮杜瓦瓶中并储存直至需要注意：我们已经发现，如果CD8 ⁺ T细胞在IL-2/ml）解冻后过夜。

代表数据

图1.克隆MP _58-66 特异性IFNγ ⁺ CD8 ⁺ T细胞。 MP _58-66特异性，IFNγ⁺ CD8 ⁺的门控策略。 A.基于正向（FSC）和侧向散射（SSC）的淋巴细胞门控; B.通过碘化丙啶染色排除死细胞，活细胞为PI阴性; C.通过FSC高度（FSC-H）和FSC宽度（FSC-W）选通策略排除双峰;当没有肽培养PBMC时，IFNγ+ CD8 + T细胞; E.与用MP sub 58-66培养的PBMC相同的门并用相同的肽再刺激。

图2.筛选生长中的CD8 + T细胞克隆的抗原特异性。 HLA-A2 ^{+或者没有肽脉冲的EBV细胞。一个洗涤每个生长克隆的样品并与这些APC一起温育过夜。第二天，通过ELISA测定上清液中IFNγ的浓度。数据表示每个克隆的重复培养物的平均值±标准偏差。选择响应MP sub 58-66分泌IFNγ的克隆用于进一步扩增。

图3.在CD8阳性+ T细胞克隆扩增后重新筛选抗原特异性。将克隆孵育与用或不用MP sub 58-66脉冲的HLA-A2 +/+ EBV细胞进行比较。孵育过夜后，通过ELISA测量上清液中的IFNγ。数据表示每个克隆的一式三份样品的平均值±标准偏差。}

食谱

细胞因子和肽的储备浓度
根据制造商的说明制备
染色缓冲区
0.5％BSA和2mM EDTA的DPBS中
细胞培养基-RPMI与5％汇集的人血清（表1）

表1. T细胞培养基的制备
碘化丙啶的浓度（1mg/ml）
通过将碘化丙啶溶解在无菌过滤的水中来制备
PMA（0.1mg/ml）和离子霉素（0.5mg/ml）的贮存浓度通过溶解在DMSO中制备
（50μg/ml）的浓度通过将除虫菌素溶解于无菌过滤的水中来制备

致谢

我们感谢Eleanora Tresoldi的技术援助和献血者为研究提供血液样本。 SIM由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC，APP1061961，APP1087341）和JDRF职业发展奖5-CDA2014210-A-N支持。圣文森特医学研究所得到维多利亚州政府运营基础设施支持计划的支持。作者没有声明利益冲突。

参考文献

Ciantar，J.P。和Mannering，S.I。（2011）。用于生长和分析人类抗原特异性CD4 + T细胞的改进方法细胞克隆。 Diabetes Metab Res Rev 27（8）：906-912。

Mannering，SI，Morris，JS，Jensen，KP，Purcell，AW，Honeyman，MC，van Endert，PM和Harrison，LC（2003）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14659909"target ="_ blank">用于检测稀有自身抗原特异性人T细胞增殖的灵敏方法。 J Immunol Methods 283 （1-2）：173-183