悬浮RKNs，其由从单个雌性建立的RKN的克隆群体组成，在水中至终浓度为至少500RKNs/ml。
注意：我们使用从现场获得的培养的RKNs。
通过将溶液注入围绕每株植物根部的土壤表面上，将1ml RKNs悬浮液接种在含有土壤的盆中生长的4周龄番茄植株（图1）。

图1.使用1ml玻璃吸管将RKNs悬浮液接种在土壤表面上
在自然阳光下在23-27℃的温室中生长植物约2个月
小心地将根从花盆里拉出，用自来水冲洗，以除去根部的土壤
用镊子从根部拿起鸡蛋块。
将收集的蛋团悬浮在培养皿中的小体积水中，在25℃下在黑暗中孵育（图2）。

图2.含有收集的RKN蛋团的培养皿
在大多数幼体孵化（约10-14天）后，使用玻璃吸管真空孵育线虫的悬浮液并释放在玻璃瓶上（图3）。

图3.将孵化的RKN青少年转移到玻璃瓶
将收集的RKNs悬浮于5-10ml水中。
在光学显微镜下计数悬浮液中RKN的数目（图4）

图4.在幼年计数之前在光学显微镜下悬浮RKN。比例尺，5毫米。
准备足够浓度的RKNs在水中的等分试样注意：我们调整500 RKNs/ml。您可以在保持在10°C的冰箱中储存RKN悬浮液，而不会失去活动2-3周，直到使用。
每次分析使用适当的等分试样。

植物生长

西红柿

在1.0％次氯酸钠溶液中灭菌种子3分钟
在70％乙醇中洗涤灭菌的种子
在灭菌蒸馏水中洗涤灭菌的种子三次。
在灭菌的湿纸上，在23-27℃下，以16小时光照和8小时黑暗的光周期发芽种子。
将7至10天龄的幼苗转移到装在220ml塑料盆中的高压灭菌的沙子中，并在保持在23-27℃的室中生长，光周期为16小时光照和8小时黑暗。每3天向盆中施加用水稀释3,000倍的液体肥料。
每个测定使用番茄幼苗两个完全发育的真叶（图5）

图5.在土壤中生长的番茄植物

拟南芥植物
1. 在1.0％次氯酸钠溶液中灭菌种子3分钟
2. 在70％乙醇中洗涤灭菌的种子
3. 在灭菌蒸馏水中洗涤灭菌的种子三次。
4. 在灭菌的1.5％琼脂板上在22℃下发芽种子，光周期为16小时光照和8小时黑暗。
5. 将3周龄的幼苗转移到装在220ml塑料罐中的高压灭菌的沙子中，并在保持在22℃的室中生长，光周期为16小时光照和8小时黑暗。
6. 每5至7天，用水稀释3,000倍的液体肥料施用于盆中
7. 每个测定使用10周龄的植物（图6）注意：我们注意到，种植在沙中的拟南芥生长速度慢于土壤。因此，生长在沙中的10周龄植物的大小几乎与生长在土壤中的6周龄植物的大小相同。
  
  图6.在蛭石中生长的拟南芥植物

化学处理和RKN渗透测定

每次处理使用10株植物。
每个托盘放五个植物。
当植物根浸没在溶液中时，将2,000ml含有足够浓度的香紫苏醇或0.1％甲醇的溶液单独倒入托盘中（图7）。
注意：我们在这里提出了sclareol的方案，但是，它也可以用于其他化学品。我们使用四种浓度; 50，80，100和200μM

图7.我们的协议中使用的锅和托盘
在浸没48小时后，通过在根周围的沙子上注射1ml RKN悬浮液（用于番茄的200RKNs和用于拟南芥的500RKN），用1ml RKN悬浮液接种RKN的第二阶段幼体玻璃移液管注意：因为RKN对拟南芥根的穿透效率低于对番茄根的穿透效率，所以我们总是使用更多数量的RKN用于拟南芥。
将接种的植物在维持25℃番茄和22℃的拟南芥中的室中生长，光周期为16小时光照和8小时黑暗。

酸性品红染色
注意：酸性品红是染色线虫的染料。下面描述的方法是由McBeth等人报道的染色方法的修改版本。（1941）。

接种7天后，将根从花盆中取出，用自来水冲洗以除去海沙。
用剪刀将植物的根分离，并将根置于50ml玻璃培养瓶中
要使根脱色，在培养瓶中倒入40 ml 1.0％次氯酸钠，轻轻翻转瓶子10次以上。
孵育5分钟。
丢弃次氯酸钠后，用大量自来水冲洗根注意：因为次氯酸钠阻挡了酸性品红的染色效果，所以次氯酸钠应该在此步骤完全除去。
在培养瓶中倒入30毫升水，然后加入1毫升酸性品红。通过倒置瓶子几次混合好。
注意：瓶中的酸性品红溶液变成淡红色。如果溶液变为淡橙色，则意味着次氯酸钠仍然保留在溶液中。
将含有根的培养瓶在酸性品红溶液中在100℃的预热水浴中煮沸注意：您也可以使用微波炉代替水浴。在这种情况下，当瓶中的溶液开始起泡时，应停止微波炉。
将煮熟的根和溶液冷却至室温
丢弃酸性品红溶液，用自来水冲洗根以除去过量的酸性品红溶液
加入30ml乳酸和甘油（1:1，v/v）的混合物
根据步骤D7煮瓶。
将瓶子冷却至室温。
用自来水清洗根后，在立体显微镜下计数根中染色的RKN的数目。染色的RKN的代表性实例显示在图8中，并且对于渗透速率的香紫苏醇处理或未处理的植物的代表性结果显示在图9中。

图8.用酸性品红染色的番茄根中的RKN。比例尺，200μm。

图9.香紫苏醇对RKNs侵入番茄根部的影响。值是来自两次独立实验的平均值±SD，每次实验重复10次。星号表示与0.1％甲醇对照（Tukey's HSD试验; P <0.05）相比的统计学显着差异。

杀线虫活性测定
注意：下面描述的程序是由Chen和Dickson（2000）报告的测定的修改版本。
1. 用水稀释RKN悬浮液至浓度为100 RKNs/ml
2. 向24孔组织培养板的每个孔中加入1ml RKN悬浮液
3. 向每个孔中加入1ml含有足够浓度的香紫苏醇或0.1％甲醇的溶液
4. 在25℃的黑暗中孵育平板。
5. 在光学显微镜下计数施用化学药剂后1小时，3小时，6小时，12小时，24小时和48小时的动力和非动力RKNs的数量。
6. 为了检查RKN的运动性，向每个孔中加入几滴1M氢氧化钠（NaOH）注意：氢氧化钠可刺激RKN的运动。如果RKN通过加入NaOH而移动，我们将其视为活的RKN。
7. 计算活RKN与死RKN的比率（图10）。
  
  图10.100μM香紫苏醇的杀线虫活性将1ml线虫悬浮液中的约100个RKNs加入到在24孔组织培养物中的1ml200μM香紫苏醇溶液或对照溶液（0.2％甲醇）中并在25℃下在黑暗中孵育。在孵育开始后1,3,6,12,24和48小时，计数活动性和非运动性RKN的数目（未显示一，三和六小时的数据）。

食谱

酸性品红溶液（1000ml）
将2.5g酸性品红溶于500ml水中，并向溶液中加入250ml乙酸