材料和试剂

塑料一次性盘（BG-11板）
1.5 ml微管
细长聚球藻 PCC 7942
大肠杆菌 K-12 W3110
氯霉素（Nacalai tesque，目录号：06285）
戊二醛溶液（50％水溶液）（KANTO KAGAKU，目录号：17026-32）
Tween 20（KANTO KAGAKU，目录号：40350-02）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D5652）
液氮
柠檬酸三钠二水合物（KANTO KAGAKU，目录号：37150-00）
SYTOX Green核酸染料（5mM DMSO溶液）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S7020）
BG-11液体培养基（Castenholz，1988）（参见Recipes）
BG-11板（见配方）
50x BG-11股票（见配方）
1,000x微元件A6（参见配方）
（参见配方）
。
1,000x CaCl <2> （见配方）
1,000x柠檬酸铁铵（III）棕色（见配方）
（参见配方）
1 M HEPES-KOH（pH 8.2）（参见配方）
M9培养基（Sambrook等人，1989）（参见Recipes）
10x M9盐（参见配方）
PBS缓冲液（见配方）

设备

植物生长室（TOMY，型号：CLE-405）
生长室（YAMATO，型号：IC602）
实验室振动器（TAITEC，型号：PERSONAL11）
UV/Vis分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1800）
药用冰箱（Panasonic，型号：MPR-3120CN-PJ）
Rotator（TAITEC，型号：RT-50）
FACS Calibur仪器（BD Biosciences，FACSCalibur ^TM）
100ml试管（用于培养）
Microtube离心机（TOMY，型号：MX-107）

软件

分析软件：BD CellQuest Pro（Becton-Dickinson）

程序

聚球藻7942培养物的制备
1. 将聚球藻7942在30℃在连续照明（40μE/m 2/s）下在BG-11琼脂平板上划线并预孵育1周，在植物中生长室
2. 将来自板的细胞悬浮于约1ml具有高浊度的BG-11培养基中，并稀释到OD为750的PBS为80的BG-11培养基中。
3. 将培养物在30℃下在具有2％CO 2鼓泡的连续照明（40μE/m 2/s）下温育10天。
4. 然后用新鲜的BG-11培养基将培养物稀释至OD 750 = 0.2。在黑暗条件下在30℃，2％CO 2鼓泡下孵育18小时后，将培养物转移至光条件（40μE/m 2 s/s）至重新启动细胞生长
5. 将1ml培养细胞的等分试样用于以下测定（程序C，D和E）
E的制备。大肠杆菌培养物作为标准
1. E。将大肠杆菌在生长室中在37℃下在M9琼脂平板上划线并预孵育。
2. 将来自板的细胞悬浮于约1ml具有高浊度的M9培养基中，然后稀释到OD 600为0.2的M9培养基中。
3. 将培养物在30℃下振荡孵育4小时
4. 向培养物中加入10μl20mg/ml氯霉素（终浓度20μg/ml）。
5. 在振荡温育2小时后，将1ml细胞培养物进行以下测定
固定
1. 向1ml等分的细胞培养物中加入10μl0.5％Tween 20和20μl50％戊二醛（最终浓度分别为0.005％和1％），并在4℃下温和温育30分钟通过旋转器搅拌
2. 将细胞以20,000×g离心1分钟，然后用1ml PBS洗涤，将细胞沉淀储存在-30℃直到进一步分析。
DNA染色
1. 将细胞沉淀用液N 2 2冷冻，然后在室温下解冻。
  注意：此步骤对于SYTOX Green
  的渗透是必要的
2. 将细胞沉淀重悬于50μl10μMSYTOX Green溶液中，用50mM柠檬酸三钠（pH8.0）稀释。
3. 样品在4℃下孵育过夜。
FACS分析
1. 将SYTOX Green染色的细胞进行FACS分析。将染色的细胞悬浮液（5μl）用250μlPBS稀释，并立即通过FACS分析。
2. 通过使用正向（FSC）和侧向散射（SSC）值，可以通过细胞大小和内部复杂性来选择细胞。 SYTOX Green信号对应于DNA量，并且通过FL1检测器（激光：488nm，过滤器：533/30nm）检测（图1和图2）。
  注意：可以使用FL3 em（激光：488nm，滤光片：610/20nm）基于叶绿素自发荧光来鉴定聚球藻7942细胞的信号。
3. 氯霉素处理的主峰。大肠杆菌样品，其对应于每个E的染色体的1个拷贝。大肠杆菌细胞，被提取并用作估计染色体拷贝数的标准
染色体拷贝数的估计
基于em的峰位置计算 Synechococcus 7942染色体拷贝数（约2.7Mbp）。大肠杆菌（约4.7Mbp）（图3）。在我们的培养条件下（黑暗下2-4个拷贝，光照条件下3-8个拷贝）改变了聚球蓝细菌7942的拷贝数（Watanabe等人，2015）（Binder和Chisholm，1995; Griese等人，2011）。
方程式：聚球藻7942染色体的拷贝数= FL1值聚球藻 ×4.7（大肠杆菌中的基因组大小）/FL1值大肠杆菌 ×2.7（聚球藻中的基因组大小）</b>

代表数据

图1.氯霉素处理的DNA含量曲线。。在含有20μg/ml氯霉素的M9培养基中培养2小时后，固定并分析细胞。 A.细胞大小（X轴：FSC-H）和DNA含量（Y轴）的分布。 B.DNA含量（X轴）和细胞数（Y轴）的谱。用于制备标准峰，其对应于E中的单拷贝染色体。大肠杆菌，提取主峰（星号）。底面板表示通过门控提取后获得的轮廓

图2.在光照条件下培养9小时的在黑暗（上）和滞后期聚球藻7942细胞（底部）中培养的细胞的DNA含量概况。细胞大小（X轴：FSC-H）和DNA含量（Y轴）的分布。 B.DNA含量（X轴）和细胞数（Y轴）的轮廓

图3.在光照条件下培养9小时（黑体）的黑暗（细线），滞后期聚球藻7942细胞中培养的细胞的DNA含量曲线。 strong> ，以及氯霉素处理的。大肠杆菌培养物（红色细线）。基于 E的峰位置计算集胞藻 7942染色体（约2.7Mbp）的拷贝数。大肠杆菌（约4.7 Mbp）。

食谱

BG-11液体培养基（pH8.2）/1L
50x BG-11储液20ml，
1,000x微元件A6 1 ml
1,000×K <2> HPO <4> 1ml
1,000x CaCl 2 2ml/dm2 1,000x柠檬酸铁棕（lll）1 ml
1 M HEPES-KOH（pH 8.2）20ml
H sub 2 O最多1 L
高压灭菌（A.C.）（120℃，20分钟）
BG-11板（pH 8.2）/1L
1. 2x BG-11股票
  50x BG-11储液20ml，
  1,000x微元件A6 1 ml
  1,000×K <2> HPO <4> 1ml
  1,000x CaCl 2 2ml/dm2 1,000x柠檬酸铁棕（lll）1 ml
  1,000×Na <2> 2 O 1 ml
  1 M HEPES-KOH（pH 8.2）20ml
  H sub 2 O最多500 ml
  （120℃，20分钟）
2. 2x琼脂原液
  Bacto琼脂（Nissui）15g
  H sub 2 O 500ml
  （120℃，20分钟）溶解食谱2b后，与食谱2a混合
50x BG-11股票，1 L
NaNO <3> 75g
MgSO 4·7H 2 O 3.75g/g 柠檬酸0.33克
EDTA-3Na盐0.05g
Na sub 2 CO 3 sub 1.0g
H sub 2 O最多1 L
（120℃，20分钟）
1,000x微元件A6，1 L

BO ₃ 2.86 g MnCl 2 2·4H 2 O 1.81g
ZnSO 4·7H 2 O 0.222g
Na 2 2 MoO 4 4·2H 2 O 0.391g
（NO 3）2 O 6·6H 2 O 0.0494g
CuSO 4·5H 2 O 0.08g/g H sub 2 O最多1 L
（120℃，20分钟）
1,000×K HPO <4>，100ml
HPO 3.0g
H <2> O高达100毫升
（120℃，20分钟）
1,000x CaCl 2 2，100ml
CaCl 2·2H 2 O 3.6g·
H <2> O高达100毫升
（120℃，20分钟）
1,000x柠檬酸铁铵（III）棕色，100ml
柠檬酸铁铵（III）褐色0.6g
H <2> O高达100毫升
（120℃，20分钟）
1000×Na <2> 2 3 ，100ml

O高达100毫升
（120℃，20分钟）
1 M HEPES-KOH（pH 8.2），1L
HEPES 238.3克
用KOH调节pH至8.2 （120℃，20分钟）
M9培养基，1 L
H 2 O（A.C.）895ml
10x M9盐100ml
1M MgSO 4（A.C.）1ml
40％葡萄糖（A.C.，120℃，15分钟）5ml
1％硫胺-HCl（A.C.）1ml
1M CaCl 2（A.C.）100μl
10x M9盐，1L

HPO 60
KH ₂ PO _{4 30 g
NaCl 5 g/h NH 4 Cl 10 g/g H sub 2 O最多1 L
（120℃，20分钟）}
PBS缓冲区
PBS粉末9.6g
H sub 2 O最多1 L
（120℃，20分钟）

致谢

该协议改编自Watanabe等人（2012）。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部给S.W.的赠款25850056的部分支持。

参考文献

Binder，BJ和Chisholm，SW（1995）。 Cell在海洋聚球藻中的循环调节。菌株。 Appl Environ Microbiol 61（2）：708-717。
Castenholz，RW（1988）。蓝细菌的培养方法。 Meth Enzymol 167：68-93
Griese，M.，Lange，C.和Soppa，J.（2011）。 Ploidy in cyanobacteria。 FEMS Microbiol Lett 323（2）：124-131。

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T。（1989）。细菌培养基，抗生素和细菌菌株。在：分子克隆。 A laboratory manual。 Cold Spring Harbor，A.1-13。

Watanabe，S.，Ohbayashi，R.，Shiwa，Y.，Noda，A.，Kanesaki，Y.，Chibazakura，T.and Yoshikawa，H。蓝藻多拷贝染色体的光依赖和异步复制。/a> Mol Microbiol 83（4）：856-865。

Watanabe，S.，Ohbayashi，R.，Kanesaki，Y.，Saito，N.，Chibazakura，T.，Soga，T.和Yoshikawa，H。（2015）。在蓝藻中的滞后期内强烈的DNA复制和代谢。 PLoS One 10（9）：e0136800。