材料和试剂

1.5ml Eppendorf管（Sarstedt，目录号：72.269.001）
100μM过滤器（BD，目录号：352360）
注意：目前，"Corning，Falcon ^TM，目录号：352360"。
无菌移液管吸头（Corning，目录号：4804）
23号（G）无菌针（BD，目录号：300800）
聚乙烯管PE-10（BD，Intramedic ^TM，目录号：427401）
1ml注射器（BD，目录号：309659）
15ml螺旋盖管锥形（Corning，Falcon ，目录号：352096）
50ml锥形螺旋盖管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
软木/聚苯乙烯板
小鼠
注意：我们通常使用至少4周龄的C57BL/6小鼠。可以使用性别，但最好不要在特定实验中混合性别。
异氟烷（Baxter，目录号：KDG9623）
House Dust Mite（HDM）提取物（Greer Laboratories，目录号：XPB70D3A2.5）
1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
乙醇
重组细胞因子[例如，rIL-21（由Zymogenetics赋予）; rIL-25（Biolegend，目录号：587302）或IL-33（Biolegend，目录号：580502）]
胎牛血清（FCS），热灭活（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：93595）
红细胞裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757）

设备

层流罩
啮齿动物麻醉系统[例如，Univentor 400麻醉单位或Univentor 410麻醉单位（Univentor，目录号：8323101）]
Pipette p200（Sigma-Aldrich，目录号：Z678333）
喷雾瓶用70％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：Z560847）
外科剪刀（例如，Sigma-Aldrich，目录号：Z265969）
外科线4-0（0.17mm），无菌（例如，Agnthos，目录号：14757）
不锈钢钳（，Sigma-Aldrich，目录号：Z168785）
血细胞计数器
离心机[例如，Hettich Rotina 420R（Sigma-Aldrich，目录号：Z723630）]

图1.麻醉设置。A.小鼠应该用异氟烷麻醉，仔细观察呼吸速率，以确保足够程度的麻醉，而不会太浅或太深。 B.在这种情况下的麻醉系统的实例是Univentor 400，空气流量设置为388ml/min，异氟烷浓度为3.8％。

程序

注意：使用小鼠的所有实验都应该由相关动物伦理委员会根据国家和国际指南。

过敏原致敏（第0天）
1. 新鲜制备HDM提取物在DPBS中的溶液，浓度为每40μlDPBS每只小鼠1μg（图2显示给药时间表）。
  注意：在组织培养层流罩中的无菌DPBS和良好的无菌技术足以重建HDM提取物。不进行溶液的过滤。
  
  图2. HDM诱导的气道炎症示意图
2. 麻醉鼠标，注意确保呼吸频率正常，因为太浅或太深的呼吸都会阻碍HDM溶液的有效吸收（见视频1）。良好的呼吸深度应该有规律和顺利[约。每秒1次呼吸（见视频2）]。在我们的工厂，我们使用Univentor 400，气流速度为380-400 ml/min，异氟烷浓度在3.6-4.0％之间，具体取决于小鼠的尺寸（图1）。通常，只有1-2只小鼠同时麻醉。当小鼠没有足够麻醉，你会注意到，老鼠会醒得太快，移动他们的腿，未能吸入所有40微升。当老鼠被太深的麻醉，你会注意到他们的呼吸速率很慢，但他们采取非常深的呼吸（喘息）。通常，这会导致在尝试管理卷时出现气泡。
  
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  视频1. HDM的鼻内管理
  
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  视频2.正确的麻醉深度
  
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3. 将鼠标轻轻地握在颈部的背面（非常宽松的颈部），使头部向上，后腿向下。管理40微升1微克HDM溶液到每个致敏小鼠的鼻孔（或DPBS单独作为对照小鼠），注意确保整个体积的摄取。
4. 吸收后，将鼠标保持在垂直位置约5秒，并检查以确保鼠标正常呼吸。
5. 鼠标可以返回其壳体笼，并保持在半直立的位置，以从麻醉中恢复
过敏原挑战（第7-11天）
1. 新鲜制备HDM提取物在DPBS中的溶液，浓度为10μg/40μl/小鼠
2. 麻醉小鼠和管理HDM如上所述使用10微克HDM体积为每只小鼠40微升。
3. 按照该程序，在致敏后第7,8,9,10和11天用HDM攻击小鼠。
细胞因子吸入
1. 以每只小鼠40μlDPBS的体积新鲜制备所需浓度的特定细胞因子。与HDM的情况一样，无菌DPBS和良好的无菌技术在这一步骤是重要的。精确的浓度将随着每种细胞因子和希望研究的反应而变化。重组细胞因子例如IL-25和IL-33似乎即使在低剂量（ng范围）下也产生鲁棒响应，而IL-21将在更高剂量（μg范围）引发响应。图3显示了在2015年Coquet等人之前使用的细胞因子吸入方案的时间表，尽管其他的存在可以更好地适应你自己的研究。其他细胞因子吸入方案也是常见的（Willart等人，2012; Kayamuro等人，2010; Hiromura等人，2007）。
  
  图3.细胞因子吸入示意图
2. 麻醉老鼠小心注意确保呼吸频率正常，因为太浅或太深的呼吸将阻止细胞因子溶液的有效摄取。
3. 按照HDM提取物所述，给予每只小鼠的鼻孔。
4. 该攻击可以重复3天，在最后一次攻击后24小时对小鼠实施安乐死，并收集组织
支气管肺泡灌洗（BAL）（D15与细胞因子吸入后的HDM或D3）
注意：也可以使用Han和Ziegler的类似协议，但一些细节不同于下面描述的（10）。我们提供灌肠的视频用于教学目的（见视频3）。

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视频3.通过支气管肺泡灌洗隔离气道细胞

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注意：小鼠不应该被颈椎脱臼所牺牲，因为这种方法可能损伤气管，导致气道灌洗不良。此外，它还可能导致气管周围出血。
1. 通过连接聚乙烯PE-10管准备插入气管的针，以使管从针的斜角点延伸大约3mm。确保没有锋利的边缘，管道已被切割（图4A）。填充注射器1毫升DPBS用于冲出肺。
2. 通过CO 2窒息或批准的麻醉剂过量方案使小鼠安乐死。
3. 轻轻地将鼠标放在背部，软木/聚苯乙烯泡沫塑料表面，伸展四肢，并用针固定每个爪子（图4B）。
  
  图4.通过灌洗分离细胞所需的典型设备。 A.用于进行BAL提取的设备示例。 23 G针具有附着的PE-10塑料管，从针的倾斜点延伸约3mm。 B.鼠标应该被每个肢体固定，并用70％乙醇湿毛。
4. 用70％的乙醇湿毛，并用剪刀在胸腔底部做一个切口。继续将皮肤切到颌骨底部，注意不要破坏颈部发现的任何血管（图5A）。
5. 将皮肤与颈部肌肉分开，然后向后张开以暴露颈部。
6. 使用镊子拉动周围的唾液腺和衬在气管中的肌肉，注意不要损坏气管本身（图5B）。
  
  图5.在收集灌洗之前制备小鼠。A.去除皮肤直到下颚，暴露唾液腺和颈部肌肉，气管位于其后面。 B.通过用镊子牢固地拉动以去除气管，去除颈部肌肉，包括胸腔乳突肌和包围气管的肌肉。注意不要损坏气管。
7. 一旦气管暴露，外科线（长度至少4cm）可以用镊子通过气管下面。使用两个镊子，可以通过将线缠绕在镊子中的一个上，然后使线的另一端穿过新形成的环来制造松结。
  注意：该结还有助于在灌洗过程中将针固定到位。
8. 在气管大约2/3从其进入肋骨笼的小切口。避免完全切断气管，因为这会在后续步骤中造成困难（参见视频3）。
9. 小心，连接有塑料管的针可以插入气管，直到感觉到阻力（大约10-15mm）。小心不要将其推过肺组织本身。通过沿相反方向拉动线的末端来拧紧结。这将密封肺并防止PBS在冲洗期间流出开口。
10. 将预填充有1ml DPBS的1ml注射器连接到插入气管的针。随着针的最小移动，柱塞可以向下移动以用DPBS洗涤肺和气道。关键是用非注射手保持针头的位置，以避免肺穿刺。在插入和取出DPBS时，应观察肺或肋骨的扩张和收缩。应该回收约80-90％的初始体积。这可以转移到15ml管中，并用另外1ml DPBS冲洗肺。冲洗次数应该在小鼠之间保持一致，以确保随后的细胞计数的准确性。视频2描绘了具有开放胸腔的小鼠，但这仅仅是为了教学目的，并且观察者观察肺的充气。胸腔可以在灌洗期间保持关闭
11. 将每个BAL样品在15ml管中加入到具有DPBS的6ml中并在4℃下以300×g离心5分钟。
  注意：如果通过ELISA或基于Luminex的测定法检测细胞因子或其它可溶性因子，则最好分离第1次和第2次和第2次航空公司。第一次冲洗可以在300℃下在4℃下旋转5分钟，而不添加任何体积，以便不稀释感兴趣的目标蛋白质。然后可以收集上清液并在-20℃下储存，并且可以对细胞进行进一步分析。
12. 弃去上清液，根据下游应用，在培养基或FACs缓冲液（DPBS/2％FCS）中重悬沉淀。
  注意：由于方案期间血管破裂或由于气道炎症，红细胞可存在于BAL洗涤液中。血管破裂将导致BAL的深红色。在明显的气道炎症导致组织损伤的情况下，BAL可以具有温和的稻草颜色，随着后续的灌溉而褪色。在任一情况下，在进一步的步骤之前，应使用低渗缓冲液消除红细胞。低渗缓冲液可导致嗜酸性粒细胞脱颗粒，因此在使用此类溶液时应考虑使用。在进行灌洗以减少红细胞污染之前，考虑通过在下腔静脉（IVC）切口对小鼠放血。
13. 细胞数可以通过使用台盼蓝排除死细胞的血细胞计数器来测定。在发炎肺中，典型数量范围为每个样品2.5×10 5至2.0×10 6个细胞（Coquet等人，2015）。在初始或PBS处理的肺中，应当观察到非常少的细胞（1-5×10 4个）（Cates等人，2004）。

代表数据

图6.从BAL分离的细胞的流式细胞术图。在最后一次HDM攻击后4天收集来自C57Bl/6小鼠的BAL细胞。来自暴露于HDM或初始对照的小鼠的代表性FSC-A/SSC-A概况显示在A（暴露于HDM的）和B（NaIve）中。 BAL中嗜酸性粒细胞的存在可定义为Siglec-F sup + CD11c - 细胞和肺泡巨噬细胞，如Siglec-F sup + CD11c ⁺。发炎的BAL和初始对照之间的差异通过前A中嗜酸性粒细胞的比例增加（通常值在60-90％之间）以及在后者B中几乎完全不存在而明显。

笔记

哮喘的房尘螨模型可以给出一些变异性，特别是在小鼠之间观察到的嗜酸性粒细胞数目方面，因此，如果可能，建立每组5只或更多只小鼠的实验是明智的。至关重要的是，在第0天小鼠的致敏平稳地进行，因为未能有效致敏的小鼠不会发展强烈的嗜酸粒细胞浸润到气道中;我们的模型依赖于有效的次级适应性免疫应答。动物之间的冲洗次数必须保持恒定以确保相当的细胞计数。在灌洗液中观察到血液的情况下，红细胞的溶解有助于使细胞计数错误最小化。
关于细胞因子滴注，免疫应答的类型可以通过施用的剂量改变，并且更长时间的细胞因子施用模型也是常见的。

致谢

作者承认MTC动物设施（瑞典Karolinska研究所）的服务。这项工作得到了瑞典研究委员会青年研究员奖学金和瑞典癌症协会的资助。该协议改编自Coquet等人。 2015。

参考文献

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