材料和试剂

PCR管（Fisher Scientific，目录号：14222262）
培养皿（100×15mm）（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
50ml塑料螺旋管（Midsci，目录号：C50B）
移液管吸头（无菌）（Midsci，目录号：AVR-1，AVR-4和AVR-11）
1.7ml微量离心管（无菌）（目录号：AVSS1700）
来自当地工艺品店或Miracloth（EMD Millipore，目录号：475855-1R）的Cheesecloth
文化管
1ml无针注射器（Tuberculin注射器）（Becton Dickinson，目录号：309659）
漏斗
1L玻璃锥形瓶（Pyrex牌）
镊子
血细胞计数器
骆驼毛刷
Sharpie或类似的防水标记
一次性手套
Kimwipes，棉纸或纸巾
面罩（Fisher Scientific，目录号：18-999-4542）
Kord品牌3.5英寸方底盆底部孔（Hummert International，目录号：12-1350-1）
至。具有底孔的塑料标准平台1020托盘（Hummert International，目录号：11-3000-1）
至。 Plastics Standard Flats 1020 tray without holes（Hummert International，catalog number：11-3050-1）
DOM1020塑料圆顶适合1020单位（悍马国际，目录号：11-3360-1）
透明塑料袋（高达13加仑回收束带清除垃圾袋）
禾本科镰孢菌分离Z-3639（Bowden和Leslie，1999）
拟南芥种子（Accession Columbia，N?ssen，and Wassilewskija）
Silwet L-77（Lehle种子，目录号：VIS-30）
马铃薯葡萄糖肉汤（Becton Dickinson，目录号：254920）
酵母提取物（Becton Dickinson，目录号：212750）
BD Difco琼脂（Becton Dickinson，目录号：214530）
硝酸铵（Fisher Scientific，目录号：A676）
氯化钾（Fisher Scientific，目录号：P217）
硫酸镁七水合物（Fisher Scientific，目录号：M63）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
Tris-Base（Fisher Scientific，目录号：BP152）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Fisher Scientific，目录号：S311）
十二烷基硫酸钠（Fisher Scientific，目录号：BP166）
羧甲基纤维素CMC（Sigma-Aldrich，目录号：C5678）
无菌去离子水（dH 2 O）
无菌双蒸水（ddH 2 O）
苯酚（Fisher Scientific，目录号：BP226500）
氯仿（Fisher Scientific，目录号：C607-4）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A451SK-4）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：A995-4）
引物（列于下表1）
dNTP（Sigma-Aldrich，目录号：DNTP100A-1KT）
PCR用聚合酶（Fisher Scientific，目录号：FB-6000-10）
iTaq Univeral SYBR Green Supermix（Bio-Rad，目录号：1725122）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP1356）
土壤混合物（Fafard，目录号：Fafard Growing Mix 2/C-2）
Peters 20:20:20通用化肥（Hummert International;目录号：07-5400-1）
F。禾谷镰菌大宏观悬浮液（见程序）
F。禾谷镰菌菌丝体碎片（见程序）
马铃薯葡萄糖琼脂 - 半强度（?PDA）（见配方）
羧甲基纤维素（CMC）培养基（参见配方）
拟南芥 DNA提取缓冲液（参见配方）
三平衡苯酚 - 氯仿（见配方）
喷雾孢子悬浮液（见配方）

设备

手持式雾化器
微量移液器（P20，P100和P1000）
用于培养真菌的标准实验室培养箱（Fisher Scientific，Fisher Scientific ^TM Isotemp ^TM）
用于培养拟南芥的植物生长室（Percival scientific，型号：AR-66L2）
热循环仪（Techne，型号：³ PrimeX）
实时PCR系统（Ilumina，Eco ^TM，目录号：EC-101-1001）
注意：此产品已由制造商停用。
复合显微镜（Leica，型号：DM2000）
台式离心机（Beckman）
Microfuge（Fisher Scientific，Fisher Scientific accuSpin ^TM，型号：Micro 17/Micro 17R）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，目录号：SI-0236）
基本电源凝胶电泳电源组，托盘和梳子（Bio-Rad，PowerPac ^TM，目录号：1645050）
凝胶电泳系统（Bio-Rad，目录号：1704405）

软件

方差（ANOVA）（
<0.05）（SAS Institute Inc，SAS v5.1）

程序

我们实验室的实验表明，放置 F。禾谷镰孢菌的菌丝体或大叶子在叶片表面不产生均匀感染。此外，感染的水平也是高度可变的。然而，当浸润有真菌菌丝体片段的叶子，其足够小以致可能通过气孔开口进入叶组织，导致可再现的感染。另一方面，大分生孢子较大，不能容易地渗入叶中。在拟南芥花卉组织上，大分生孢子能够发芽并成功感染组织。

禾谷镰孢分离株Z-3639的培养和用于接种拟南芥叶的真菌菌丝体悬浮液的制备
1. 将真菌培养并保持在用0.7％琼脂制成的1/2强度马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上。平板为100 mm（宽）x 15 mm（深）。
2. 为了制备真菌用于接种，培养真菌。禾本科（Graminearum）在?PDA平板上在28℃下分离Z-3639（Bowden和Leslie，1999）8-10天。随着真菌生长，它变成粉红色的红色（图1）。
  注意：
  1. 如果不存在28℃的培养箱，则真菌可以在室温下培养，但优选不低于22℃。
  2. 具有大于1个月的真菌质量的板不应用于接种物的制备。
  图1.在28℃下由于禾本科禾谷镰孢生长8天而显示红色的PDA平板
3. 10天后，用10ml无菌ddH 2 O淹没每个平板，并用软骆驼毛刷小心地从平板表面刮下菌丝体，注意不要刮去介质（参见图2）。该方法从培养基中收获真菌菌丝体，并同时将其分成较小的片段，这对随后的拟南芥叶的感染是关键的。真菌悬浮液将具有粉红色的颜色（见图2）。
  注意：对于对照接种，使用未接种禾谷镰孢的1/2 PDA平板。
4. 真菌悬浮液通过四层粗纱布过滤（或者可以使用两层miracloth）以除去碎片和较大的菌丝团（见图2）。最后，在收集来自6-7板的悬浮液后，使5ml无菌ddH 2 O通过粗棉布（或miracloth）。重复此洗涤额外的时间。通常需要约50ml的悬浮液来渗透60-70片叶子
  
  图2.从?PDA平板制备真菌菌丝体片段。左图：用骆驼毛刷从?PDA平板收获真菌菌丝体。中图：通过干酪包布过滤真菌菌丝体悬浮液。右图：具有过滤的真菌菌丝体悬浮液的培养管
禾本科镰孢菌的分离分离Z-3639和制备用于接种拟南芥花卉组织的真菌孢子
1. 培养 F。禾谷镰孢在?PDA平板上在28℃下培养8-10天，如上所述。
2. 为了促进孢子形成，从显示出大量真菌生长的PDA平板上切下真菌菌丝体团的1/4英寸平方英寸的真菌塞，并放置在含有250ml无菌羧甲基的1L锥形瓶中纤维素介质
3. 将真菌接种的CMC培养基（参见Recipes）在摇瓶上以100rpm在28℃下培养7-9天，直到观察到大量泛素化。
4. 真菌悬浮液通过四层干酪布过滤以除去碎片和菌丝团。
5. 将含有大分子的滤液在台式摇摆式离心机中以3,000xg离心10分钟。
6. 通过将沉淀的大分生孢子重悬浮于10ml无菌ddH 2 O中，然后如上所述在室温下以3,000xg离心10分钟来洗涤沉淀的大分生孢子。该洗涤再重复一次。
7. 将沉淀的大分生孢子（图3）在含有0.001％Silwet L-77的无菌ddH 2 O水中再悬浮至1×10 5大分生孢子/ml的浓度。
  
  图3. 禾本科镰刀菌大分生孢子。条形代表20μm。
拟南芥栽培
1. 使用基于堆肥的Fafard＃2土壤混合物培养拟南芥。土壤首先通过高压灭菌如下灭菌：将足以半高压灭菌高压釜袋的土壤与足够的水混合直至完全饱和。同时，必须小心打破大块土壤以确保均匀的土壤饱和。
2. 将松散封闭的袋高压灭菌1小时。然后使土壤冷却至室温（过夜），然后使用。
3. 将经高压灭菌，但冷却的土壤松散地装入具有底部孔的Kord品牌3.5"方形罐中，所述底部孔放置在具有底部孔的20-9/16"×10-3/16"×2-3/8"进一步放置在没有孔的20-9/16"×10-3/16"×2-3/8"1020盘中（参见图4）。
  
  图4. 拟南芥栽培装置，其包含在具有孔的托盘中的3.5"盆，其又包含在没有孔的托盘中 >
4. 通过用含有0.4g /加仑的Peters 20:20:20肥料的自来水填充最外层托盘并将放置在其中具有底孔的托盘中的填充土壤的盆放入其中来对土壤进行灌溉。
5. 通过毛细作用使土壤湿润，直到土壤表面润湿良好。
6. 通过提起具有底部孔的托盘排出多余的水，该底部孔包含在水位以上的罐。
7. 没有孔的平面中的水被排出。
8. 将带有底孔的平板中的排水罐返回到没有孔的托盘。
9. 每盆两个种子用润湿的牙签放在土壤表面，每次一个种子。
10. 在所有盆播种后，用透明DOM1020塑料圆顶覆盖托盘中的整个盆设置，并转移到冷室中，在那里将其放置在黑暗中用于分层。
11. 两天后，将具有罐的托盘移至设定在22℃的生长室或生长室中，在14小时光照（80μEm -2s -1 <1s -1）下）/10h黑暗区域，具有约60％的相对湿度（RH）。
12. 大约四周龄的植物用于用真菌菌丝体片段接种叶组织，而具有无分支螺栓的6-7周龄植物用于用真菌大分生孢子接种花序组织。
禾本科镰刀菌叶感染
1. 用禾本科禾谷镰孢菌菌体碎片接种拟南芥叶
  1. 使用约四周龄的拟南芥植物。在每个实验中包括适当的对照基因型是重要的。在接种前一天浇水植物。感染通常在下午时间完成。
  2. 用于接种的扩展叶用防水标记标记。每株植物接种约4-5片叶。每种处理需要来自每种基因型的15株植物的至少60片叶子（模拟v/s真菌）。
  3. 使用1ml无针注射器将真菌菌丝体碎片的悬浮液渗入拟南芥叶的背面（下侧）（图5）。叶浸润在中间静脉的每一侧，直到整个叶区域浸润。对照（模拟）处理涉及通过没有真菌的PDA平板上的水，并且类似于真菌培养物的处理。
    注意：进行真菌接种时，请使用手套，眼睛保护和实验室外套。收集所有与真菌培养物接触的废物，并在处理前进行高压灭菌。
  4. 浸润后，用透明圆顶覆盖植物48小时以保持高湿度并促进真菌感染。
  图5.真菌浸润到拟南芥叶中。显示的是用无针注射器将真菌培养物浸润到拟南芥叶的背面（下表面） em>叶。
2. 对拟南芥叶片禾谷镰孢菌病的严重程度进行评分
  1. 在接种后5天，在叶中观察到病害传播，作为褪绿的扩展和严重性。然而，由于疾病进展取决于真菌接种物的质量，如果疾病进展缓慢，则可以在第6天或甚至第7天监测疾病严重性。
  2. 接种的叶子的百分比， 25％（I类），25-50％（II类），50-75％（III类）和>对于每种基因型确定75％（IV类）叶面积（图6）。对于相对于植物DNA的真菌DNA的PCR分析用于确认感染过程中的真菌生长（图7左图），并确定疾病严重性和病叶中真菌生长之间的相关性（图7右图）。
  3. 评估来自每种基因型的15株植物的最少60片叶的疾病严重性。
  4. 使用公式
    计算疾病严重程度指数
    在哪里，
    I =疾病严重程度分数：1类，I类，2类，II类，3类，III类，4类，IV类 n _I =每个分数的叶数，
    N =总叶数，
    k =最高分（在这种情况下为4分）。
  5. 使用单因素方差分析（ANOVA）（P <0.05）（SAS v5.1）来比较不同基因型中的疾病严重性。图8显示了比较拟南芥登记号Columbia（Col-0）的野生型（WT）植物与表现出增强抗性的两种突变体mut-1和mut-2之间的疾病严重性的代表性数据集。
  图6.在禾本科镰刀菌感染的叶中的疾病症状。根据显示缺绿的叶面积的程度，将疾病叶分为四组。
  
  图7.真菌DNA的PCR分析。左图：对从感染叶提取的DNA上的真菌和植物基因进行PCR（25和30个循环） 25％（泳道1），25-50％（泳道2），50-75％（泳道3），和> 75％（泳道4）萎黄病。右图：从接种后第2,4和6天（dpi）收集的15个合并叶中提取的DNA上的真菌和植物基因的PCR（25和30个循环）。用对真菌NahG（ FgNahG ）和 TUBULIN （ FgTUB ）基因特异性的引物进行PCR， a控制拟南芥ACT8 （ AtACT8 ）基因。
  
  图8.拟南芥野生型登录Col-0和两个突变体（mut-1和mut-2）叶片中的禾谷镰孢菌病病情严重性接种的叶的百分比， 25％，25-50％，50-75％和>对于每种基因型确定5dpi处的叶面积的75％。每种基因型的疾病严重程度指数显示在右侧
3. 通过PCR监测真菌生长
  处理感染的叶组织以提取DNA，其包括植物和真菌DNA。
  1. DNA提取
  2. 用于监测拟南芥叶中真菌生长的PCR
  3. 基于qPCR的定量拟南芥叶中真菌生长
    在Eco Illumina系统上使用Sybr？Green PCR Master Mix进行真菌基因（fgNahG 和 FgTUB ）的定量PCR（qPCR）任何可比较的实时PCR仪）使用以下扩增方案：在95℃下10分钟用于聚合酶活化和核酸变性，随后是95℃10秒，58℃30秒和72℃的40个循环30秒。随后是产物熔化以确认单一PCR产物。通过从C T中减去EF1α的C T值，将基因表达水平标准化为拟南芥EF1α的水平。真菌基因的亚基值。使用ΔΔC方法（Livak和Schmittgen，2001）计算相对倍数变化。以图9为例。
    
    图9.用于监测真菌生长的qPCR分析相对于拟南芥EF1α的真菌FgNahG 基因的qPCR分析对从提取的DNA进行的 > Fg - 感染的叶子。
    
    表1. PCR引物
  4. 通过用含有0.4g /加仑的Peters 20:20:20肥料的自来水填充最外层托盘并将放置在其中具有底孔的托盘中的填充土壤的盆放入其中来对土壤进行灌溉。
  5. 通过毛细作用使土壤湿润，直到土壤表面润湿良好。
  6. 通过提起具有底部孔的托盘排出多余的水，该底部孔包含在水位以上的罐。
  7. 没有孔的平面中的水被排出。
感染了禾本科禾谷镰菌的拟南芥花粉组织的疾病评价
1. 植物接种
2. 镰刀菌 - 拟南芥病疾病（FAD）评分
  1. 从第3天起监测个体花序的疾病症状，在接种后7天取得最终疾病评分。然而，如果疾病的进展快速，那么最终的疾病得分可以在第5或6天进行
  2. 由Urban等人开发的数字评分系统。（2002）（表2）用于获得镰孢 - 拟南芥病（FAD）评分。
  3. 针对三个独立的花亚组分评估疾病表型（i）花（F）：覆盖开放花和芽的感染。（ii）新长角果（NS）：在从接种时完全开放的花接种后形成的长角果上的感染严重性。这些花位于真菌接种时位于茎上的永久标记的上方。（iii）较老的长角果（OS）：在真菌接种时存在的长角果的感染严重性。对于这些组分中的每一种，基于症状的宏观评估（图10）对感染的严重性进行分类，如表2所示。
  4. 通过加入三个亚组分分数来计算最终的镰孢属 - 拟南芥病（FAD）值，即F + NS + OS = FAD，如Urban > et al 。（2002）。代表性数据集在表3中给出。
  5. FAD值为3及以下的拟南芥基因型被分类为表现出对Fg的抗性，而具有10以上的值的那些基因型被分类为易感的。
  表2.疾病表型的分类以及花，新老角果的分数。改编自Urban等人。（2002）。
  
  在真菌接种后七天期间形成的丝状体 ^b在用真菌大分生孢子喷洒植物时存在的短枝
  
  图10.拟南芥花序中的禾本科禾谷镰孢病的症状。 A.显示疾病症状的敏感花序。 B.相对耐受的花序，显示由在真菌大分生孢子接种时7天前出现的花产生的新鲜花和长角果。
  
  表3.拟南芥 WT登录Col-0和mut-1和em-mut的花序上的禾谷镰孢菌病 2 突变体

食谱

马铃薯葡萄糖琼脂 - 半强度（?PDA）
马铃薯葡萄糖肉汤粉末19.5克
琼脂7.0克
蒸馏水1000 ml
在添加琼脂之前，在25℃下将pH调节至5.6±0.2 通过高压灭菌20分钟灭菌。倒入并允许在每个100×15mm培养皿中设置约30ml
羧甲基纤维素（CMC）培养基
NH 4 NO 3 Sub 1.0g
KCl 0.2 g
MgSO 4·7H 2 O 1.0g
酵母提取物1.0g
羧甲基纤维素26.0克
蒸馏水至1000 ml
通过高压灭菌20分钟灭菌。
拟南芥 DNA提取缓冲区
200mM Tris-Cl，pH 7.5（Sambrook等人，1989） 250mM NaCl 25mM EDTA，pH 7.5（Sambrook et al。，1989）
0.5％SDS
三平衡的苯酚 - 氯仿（Sambrook等人，1989）
喷雾孢子悬浮液
1×10 5孢子/ml，在含有0.001％Silwet L-77的无菌ddH 2 O水中。

致谢

这项工作得到了来自美国农业部（协议＃59-0200-3-003和59-0790-8-060）的资助，作为与美国小麦&大麦痂病倡议。这里描述的方案基于由Makandar等人开发和描述的程序。（2010），Nalam等人。（2015）和Urban 等。（2002）。

参考文献

Bowden，RL和Leslie，JF（1999）。性在玉米赤霉中重组。 Phytopathology 89（2）：182-188。
Livak，KJ和Schmittgen，TD（2001）。分析的相对基因表达数据，使用实时定量PCR和2（-DΔDelta C（T））方法。方法 25（4）：402-408。
Makandar，R.，Nalam，V.，Chaturvedi，R.，Jeannotte，R.，Sparks，AA和Shah，J。（2010）。简化禾本科镰刀菌拟南芥和小麦中的9-脂氧合酶的感染。 Mol Plant Microbe Interact 28（10）：1142-1152。
Sambrook，J.，Fritch，EF和Maniatis，T。（1989）。分子克隆：实验室手册 Cold Spring Harbor Laboratory 。
Urban，M.，Daniels，S.，Mott，E.，and Hammond-Kosack，K.（2002）。拟南芥易受谷物耳枯萎真菌病原体镰刀菌和禾谷镰孢菌的侵袭， em> Fusarium culmorum 。 32：961-973。