材料和试剂

移液器提示
分生孢子。禾本科（最好是新鲜，不冻）
Seahorse XF细胞水分胁迫测试试剂盒，包括寡霉素，鱼藤酮，抗霉素A和氰化物 - 对三氟甲氧基苯基腙（Seahorse Bioscience，目录号：103015-100）
包含XF24盒和Islet捕获微板的Seahorse XF24 Islet FluxPak（Seahorse Bioscience，目录号：101174-100）
校准物溶液（Seahorse Bioscience，目录号：103059-000）
（Carl Roth，目录号：X886.1）的紫外线吸收剂。
（Carl Roth，目录号：P018.1）
MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：230391-500G）
NaCl（Carl Roth，目录号：9265.1）
蔗糖
（Carl Roth，目录号：6943.1）
CuSO 4·5H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：209198-250G）
KI（Carl Roth，目录号：6750.1）
MnSO 4 H·H 2 O（Carl Roth，目录号：7347.2）
（NH 4）6 Mo 7 Mo 24 SO 4·4H 2 O（Sigma公司） -Aldrich，目录号：09880-100G）
ZnSO 4 7HH 2 O（Carl Roth，目录号：7316.1）
FeCl 3·6H 2 O（Carl Roth，目录号：7119.1）
解决方案A（参见配方）
解决方案B（参见配方）
暂停D（参见配方）
最小培养基（见配方）

设备

多通道移液管（Sigma-Aldrich，目录号：Z683930-1EA）
XF24胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience，型号：Seahorse XFe24）
28℃培养箱（Heraeus B20/UB20）（Thermo Fisher Scientific，目录号：50061005）
微孔板离心机（Eppendorf，目录号：022620509）

软件

XF24细胞外通量分析仪软件
电子表格软件程序[例如。，Excel（Microsoft）]

程序

OCR测量的所有步骤总结在图1中。本节介绍在海马控制器上设置适当的程序。注射化合物随后将通过空气压力注射到所有孔中。

编程35分钟的平衡步骤。
测量OCR
1. 编程三个测量循环：2分钟混合，2分钟延迟，3分钟测量
2. 任选：使用注射口A注射50μl测试物质，例如，γ氨基（5mM终浓度）（B?nighausen等人，2015）。
3. 注射测试物质后进行20个测量循环（2分钟混合，2分钟延迟，3分钟测量）
4. 使用注射端口B注射寡霉素（55μl，4μM终浓度）。寡霉素用于估计ATP合成所消耗的氧气量。
5. 立即执行3-6次测量循环（2分钟混合，2分钟延迟，3分钟测量）
6. 使用注射端口C注射氰化物 - 对三氟甲氧基苯基腙（FCCP）（60μl，4μM终浓度）。 FCCP解耦呼吸链。其应用允许估计备用呼吸能力。
7. 立即执行3-6次测量循环（2分钟混合，2分钟延迟，3分钟测量）
8. 使用注射端口D注射鱼藤酮和抗霉素A（65μl，4μM终浓度）。鱼藤酮和抗霉素A分别抑制线粒体电子传递链的复合物I和II，从而完全消除线粒体呼吸。
9. 立即执行3-6次测量循环（2分钟混合，2分钟延迟，3分钟测量）。
图1.禾本科镰刀菌的耗氧量测量工作流程

前一天的准备工作
根据制造商的说明，在测定前24小时，在校准液中在28℃的培养箱中水化盒，打开XF24分析仪，启动XF24软件，并允许仪器获得28℃的稳定温度。 />
将捕获屏幕与捕获屏幕插入工具插入XF24 Islet捕获微板
向XF24胰岛捕获微板的每个孔中加入450μl新鲜制备的基本培养基
将5,000个分生孢子（50μl的100分生孢子悬浮液在水中）加入到XF24岛捕获微板中，将两个孔空白用于背景扣除。
在室温下将平板在1,000×g下离心2分钟，得到捕获屏幕下方的所有分生孢子。
在28℃孵育24小时（禾谷镰孢的最适生长温度）。
检查解剖显微镜下的分生孢子发芽（图2）
用新鲜的基本培养基更换培养基，用移液管吸取捕获屏幕上方的液体，并用新鲜的基本培养基（室温下为500μl）替换。
孵育板在28℃下1小时，以允许菌丝体调整到新的媒体。更长的孵育可能导致培养基中由于生长的真菌的摄取而导致的氮耗竭。
按照程序部分中预定义的方式装载墨盒的进样口，然后按照XF24控制器的说明开始校准水化墨盒。
将胰岛微孔板插入XF24细胞外通量分析仪，开始运行
根据XF24 Seahorse软件和操作手册和电子表格软件程序分析数据。

图2.禾本科镰孢菌的真菌菌丝体。用5,000个分生孢子接种填充有450μl基本培养基的XF24岛捕获微板，并在28℃温育24小时。比例尺：100μm

代表数据

根据上述程序的真菌呼吸的测量通常应当导致如图3所示的OCR。我们建议每个实验组重复5次。

图3.在液体基本培养基中生长的禾生镰孢菌的菌丝体的氧消耗速率

笔记

这里描述的无菌培养中的氧消耗速率的测量是高度可重复的。

食谱

解决方案A
100g/L Ca（NO 3）2 H 4·4H 2 O·
解决方案B
20g/L KH 2 PO 4
MgSO 4/7H 2 O 25/g/L MgSO 4/7H 2 O 10g/L NaCl，通过过滤灭菌
暂停D
60g/L H sub 3 BO 3 sub
390mg/L CuSO 4·5H 2 O·dm / 13 mg/L KI
60mg/L MnSO 4 H·H 2 O·m / 51mg/L（NH 4）6 Mo 7 Mo 24 SO 4·4H 2 > O
5.48g/L ZnSO 4·7H 2 O·h/v 932mg/L FeCl 3·6H 2 O·h/v
最小培养基（1L）
10ml溶液A
10ml溶液B
10g蔗糖 1 ml的悬浮液D

致谢

作者感谢汉堡大学的"Kompetenzzentrum NachhaltigeUniversit?t"资助。

参考文献

Bemann，J.，Gebhard，D.，Kr?ger，C.，Hadeler，B.，Tumforde，T.，Lieberei，R.，Bergemann，J.，Sch?fer，W。和Bormann，J。中断GABA分流会影响线粒体呼吸和毒力谷类病原体禾谷镰孢。分子微生物学 98（6）：1115-1132。
Gerencser，AA，Neilson，A.，Choi，SW，Edman，U.，Yadava，N.，Oh，RJ，Ferrick，DA，Nicholls，DGand Brand，MD（2009）。< a class ="ke -insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19555051"target ="_ blank">基于定量微孔板的肺活量测定法与氧扩散校正 Anal Chem 81（16）：6868-6878。
Divakaruni，AS，Paradyse，A.，Ferrick，DA，Murphy，AN and Jastroch，M.（2014）。基于微孔板的氧消耗和pH数据的分析和解释方法Enzymol 547：309-354。