材料和试剂

玻璃试管，18×150mm（VWR International，目录号：60825-443）
50ml离心管（Corning，目录号：430829）
带有O形环的螺旋顶微量离心管，2.0ml（Laboratory Product Sales，目录号：L233072）
玻璃珠，0.1mm（BioSpec Products，目录号：11079101）
离心过滤器，0.5ml，10,000MWCO（Merck Millipore Corporation，Amicon，目录号：UFC501024）
微量离心管，1.7ml（Laboratory Product Sales，目录号：L211511）
感兴趣的变异链球菌菌株
脑心浸液培养基（BHI）（BD，Difco ^TM，目录号：299070）
细菌琼脂（BD，Difco ^TM，目录号：214010）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T5816）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氯化钠（J.T.Baker，目录号：3624-01）
噻唑基蓝四唑溴化物（MTT）（Sigma-Aldrich，目录号：M2128）
吩嗪硫酸乙酯（PES）（Sigma-Aldrich，目录号：P4544）
来自酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh）（Sigma-Aldrich，目录号：A3263）
乙醇，200proof（VWR International，Koptec，目录号：64175）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8875）
碳酸钠（J.T.Baker，目录号：3602-01）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N3376）
盐酸（J.T.Baker，目录号：9535）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钠盐水合物（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）
1 M tricine-NaOH（见配方）
40 mM EDTA溶液（参见配方）
6 M NaCl（见配方）
0.1 M NaCl（见配方）
4.2 mM MTT（参见配方）
16.6 mM PES（见配方）
100 U/ml Adh（参见配方）
NAD ⁺/NADH主混合物（参见配方）
NAD ⁺/NADH提取缓冲液（参见配方）
2μMNADH（参见配方）

设备

（1μl）接种环（VWR，目录号：50807-020）
CO 2培养箱（LABEQUIP）（VWR Scientific，目录号：10810-744）
锥形烧瓶，250ml（Pyrex）
Mini Beadbeater 8（BioSpec Products，型号：Mini Beadbeater 8）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
用Thermo摆动转子（Thermo Fisher Scientific，型号：TX-750）离心（Fisher Scientific，型号：Legend RT）
60°C水浴
37°C水浴
Vortexer（Vortex Genie 2）（Scientific Indudtries，型号：G560）
暗室

程序

制备S。 mutans 细胞沉淀（注1）
1. S。使用1μl环在BHI平板（37g/L BHI; 15g/L Bacto琼脂）上将感兴趣的变异菌株感兴趣的菌株划线，以从冷冻培养物储备液中分离，并在37℃下在5％（v/v）CO 2/95％空气培养箱
2. 使用无菌技术，用1μl环挑取分离的菌落，并用于在无菌玻璃试管中接种5ml BHI。培养物在37℃下在5％（v/v）CO 2/95％空气培养箱（注2）。
3. 使用无菌技术，将5ml过夜培养物用于在无菌125ml培养瓶中接种45ml BHI。培养物在37℃下在5％（v/v）CO 2/95％空气培养箱中生长，直到培养物在600nm处的吸光度（OD大于600）达到〜0.6（中期对数期生长，对于菌株UA159约4小时）
4. 将培养物转移到50ml锥形离心管中，通过在4℃下以4,000rpm（2,272×g）离心15分钟收获细胞。将细胞沉淀置于-80℃直至进行测定
来自S的细胞提取物的制备。变异
1. 将冷冻的细胞沉淀在冰上解冻，并重悬浮于1ml冰冷的NAD + +/NADH提取缓冲液中（Frezza等人，2011）。
2. 将样品转移到含有0.5g玻璃珠的2.0ml带螺旋盖的微量离心管中
3. 将样品在Mini Beadbeater中在4℃下"匀化"速度设置均化30秒循环，随后在冰上孵育2分钟，然后再在另一个30秒循环中匀化两次。
4. 将匀化的样品在4℃下在微量离心机中以14,000×g离心5分钟。
5. 除去上清液并转移到10,000MWCO离心过滤器（注3）
6. 将上清液在4℃以14,000×g离心通过过滤器。使用样品尺寸，过滤通常需要约30分钟。
7. 将滤液在新鲜的微量离心管（每个〜400μl）中分成两个等体积，一个用于测定总NAD/NADH（NAD总共），一个用于测定NADH。从这一点直到步骤C7，协议必须在暗室中进行（注4）。
8. 仅将NADH的样品等分试样在60℃水浴中温育30分钟以除去NAD +，然后转移至冰（NAD +是热不稳定的，NADH不是）。在整个步骤（注释5）中，将用于测定NAD总量的等分试样保持在冰上。
NAD ⁺/NADH循环试验
1. 将500μl主混合物（Gibon和Larher，1997）分装到适当数量的微量离心管（注5）中。
2. 向含有主混合物的每个离心管中加入100μl样品，NADH标准品或NAD ⁺/NADH提取缓冲液（空白）。
3. 用0.1 M NaCl使每个反应体积为900μl，短暂涡旋
4. 在37℃水浴中孵育反应5分钟（注6）
5. 向每个反应中加入100μlAdh（含10U），短暂涡旋
6. 在37℃水浴中孵育反应40分钟
7. 加入500微升6 M NaCl停止每个反应，沉淀还原的MTT。短暂涡旋。反应不再对光敏感，并且方案的其余部分可以在标准光照条件下进行
8. 离心机在4℃和10,000xg下停止反应5分钟
9. 滗析管（注7），并将颗粒重悬于1ml 200级乙醇中
10. 使用含有100μlNAD + sup/NAD//NADH提取缓冲液的样品作为空白，分析样品和标准物在570nm处的吸光度。使用已知量的NADH（在上述步骤C2中添加）产生标准曲线，并用于计算未知样品的浓度。通过NAD _- -NADH计算NAD ⁺

笔记

本协议的A部分描述了制备S。但是作者期望方案的下游部分（部分B和进一步）用于任何革兰氏阳性细菌物种和生长条件。除了 S。突变体分批培养，作者还成功地对 S样品进行了测定。变异体在连续培养中生长
作为兼性厌氧菌，变异链球菌通常在无搅拌下生长。
这一步骤从细胞提取物中除去细胞碎片和蛋白质，防止多价螯合，降解，氧化或NAD（H）的减少。
从这一点直到步骤C7，协议必须在暗室中进行，只有间接光源，以防止NAD（H），MTT和PES的氧化。
如步骤B8中所述的30分钟孵育期间的配方中所述，对于每个测定新鲜制备NAD +主要混合物和NADH标准品。应对每个样品的几个稀释液进行测定，以确保所得吸光度值落在所生成的标准曲线的线性范围内。代表性的标准曲线显示在图2中。作者使用0pmol，10pmol，25pmol，50pmol，100pmol和200pmol的溶液以产生标准曲线。由于通常比NADH具有更大比例的游离细胞内NAD +，因此可能NAD +总样品将需要比NADH样品更大程度的稀释。除了100μl的非稀释样品外，作者建议在100μl的1:5，1:10和1:50稀释的NAD 总样品和100μl的1： 2,1：5和1:10稀释的NADH样品。对于每个样品和标准品，进行三次重复测定。还必须使用100μlNAD ⁺/NADH提取缓冲液进行阴性对照反应（以在分光光度计中用作空白）。

图2.由几种已知浓度的NADH
产生的标准曲线的实例
在37℃孵育导致所有NADH氧化为NAD + sup/+。
在此步骤之后，样品不再具有高的光敏性，并且可以在标准照明条件下进行方案的其余部分

食谱

1M Tris-NaOH（pH8）
向80ml H 2 O中加入17.92g三辛胺用NaOH调节pH至8.0 用H 2 O使溶液体积为100ml。在RT存储。
40mM EDTA
将1.49g EDTA加入到80ml H 2 O中用H 2 O使溶液体积为100ml。存储在RT。
6 M NaCl
将35.04g NaCl加入到80ml H 2 O中用H 2 O使溶液体积为100ml。存储在RT。
0.1 M NaCl
将0.584g NaCl加入到80ml H 2 O中用H 2 O使溶液体积为100ml。存储在RT。
4.2 mM MTT
将0.0087g MTT加入到5ml H 2 O中每次执行协议时保持新鲜，并保持在黑暗中。
16.6mM PES
将0.028g PES加入到5ml H 2 O中每次执行协议时保持新鲜，并保持在黑暗中。
100 U/ml Adh
将适当量的Adh粉末加入到0.1M tricine-NaOH（pH8）中以获得100U/ml（每mg固体的活性单位可以从提供的总单位和在每个酶管的标签上提供的mg固体计算）。
每次执行协议时准备新鲜。
NAD ⁺/NADH主混合物
每次执行协议时准备新鲜。
基于待进行的反应的数量（每个反应500μl）制备体积。
必须混合并储存在黑暗中。
每个反应加：
100μl1M tricine-NaOH（pH8）
100μl40mM EDTA
100μl0.1M NaCl
100μl4.2mM MTT
100μl16.6mM PES
100μl200标准乙醇
NAD +提取缓冲液pH10.3（100ml）向80ml H 2 O中加入：
0.168g碳酸氢钠（终浓度20mM） 1.06g碳酸钠（终浓度100mM） 50μlTriton-X 100（终浓度0.05％） 0.122g烟酰胺（终浓度为10mM）试剂溶解后，用1M HCl调节pH至10.3 加至最终体积为100ml。
存储在RT。
2μMNADH（用于标准曲线制备）
加入0.007mg至5ml H 2 O x/v 该量产生1000倍的溶液，因此需要3个连续稀释（100μl加入900μlH 2 O）以获得1倍工作原料。
标准曲线
0pmol NADH = 1ml H 2 O 2 / 10pmol NADH =5μl2μMNADH加入995μlH 2 O中
25pmol NADH =12.5μl的2μMNADH加入到987.5μlH 2 O中
50pmol NADH =25μl的2μMNADH加入到975μlH 2 O中
100pmol NADH =50μl的2μMNADH加入到950μlH 2 O中
200pmol NADH =100μl2μMNADH加入900μlH 2 O中

致谢

这项工作得到了NIH/NIDCR T90-DE021985（J.L.B。）培训计划和NIH/NIDCR DE-13683（R.G.Q），NIH/NIDCR DE-17425（R.G.Q.）的支持。
该循环测定是Bernofsky和Swan（1973）首先描述的方案的修改版本，使用Frezza等人描述的提取缓冲液（2011），随后是由Gibbon和Larher（1977）描述的减少的MTT沉淀。

参考文献

Bernofsky，C。和Swan，M。（1973）。用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的改进的循环试验。 Anal Biochem 53（2）：452-458。

Freestyle，C.，Zheng，L.，Tennant，DA，Papkovsky，DB，Hedley，BA，Kalna，G.，Watson，DG和Gottlieb，E。 href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21912692"target ="_ blank">缺氧细胞的代谢分析揭示了细胞存活所需的分解代谢特征。 6（9）：e24411。

Gibon，Y。和Larher，F。（1997）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的循环测定：还原四唑的NaCl沉淀和乙醇溶解。 Anal Biochem 251（2）：153-157。

Nisselbaum，JS和Green，S.（1969）。一种用于测定组织中吡啶核苷酸的简单超微方法。 Anal Biochem 27（2）：212-217。

Ying，W。（2008）。 NAD ⁺/NADH和NADP ⁺/NADPH在细胞功能和细胞死亡中的表达：调节和生物学结果 Antioxid Redox Signal 10 179-206。