材料和试剂

多聚甲醛（PFA）
它可以作为16％PFA从Electron Microscopy Sciences（目录号：15710）订购，并在使用前稀释至4％。然而，我们通常从粉末（Sigma-Aldrich，目录号：158127）制备4％的溶液。这里是如何使4％PFA：
1. 在500瓶中，称重80g PBS中的4g PFA
2. 在磁力加热器上搅拌并加热混合物。在整个过程中保持温度低于60°C，以避免聚合物的分解。
3. 当温度接近60℃时，加入几滴10N氢氧化钠。混合物将逐渐变清。
4. 将溶液过滤到新的烧瓶中并冷却至室温。
5. 用盐酸中和至pH为7.
6. 加入PBS至100 ml。
O.C.T. （TFM组织冷冻培养基，TFM-5，透明颜色）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
山羊血清
Triton X-100
次级抗体：
Cy2（或cy3或cy5）结合的山羊抗小鼠（或兔）IgG。
（Jackson ImmunoResearch，经亲和纯化的抗体的F（ab）2片段）
Hoechst33258（Sigma-Aldrich，目录号：861405）
抗褪色试剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：P36930）
乙醇
4 N盐酸
氢氧化钠
阻止缓冲区（参见配方）

设备

塑料低温模具（Ted Pella，目录号：27110）
冷冻切片机
SuperFrost Plus载玻片（VWR International，目录号：48311-703）
黑暗加湿室：从包含浸泡在水中的kimwipes的方形培养皿制成。用铝箔包裹室以保护载玻片免受光照。
PAP笔
500瓶
冰桶
磁性加热器

程序

灌注胚胎（E15-19）与4％多聚甲醛。在4％多聚甲醛中解剖大脑和后缀一夜。
在塑料低温模型中，将大脑嵌入O.C.T.中，嗅球朝下。
在冰桶中，小心地将一些干冰滴入100ml乙醇中。当气泡停止爆裂时，小心地将模具转移到干冰冷却的乙醇中。在O.C.T.之前观察大脑的方向。冻结。避免乙醇溅入模具。当O.C.T.块完全冻结，将块储存在-20°C。组织在-20℃下可以保持两个月，但是在新鲜冷冻的组织上获得最好的染色结果
切片机的截面脑，厚度为10-20微米。将大脑连接到SuperFrost Plus幻灯片。空气干燥切片20分钟。切片可以在-20℃下储存两个月，但是在新鲜切割的组织上获得最好的染色结果。在黑暗的加湿室中进行以下染色程序
用PBS洗涤3次，以清除O.C.T. （可选：对于BrdU染色，将脑切片在室温（RT）下在4N盐酸中孵育2小时以暴露抗原，然后是三在PBS中洗涤）
稍微干燥载片，但确保组织切片保持湿润。使用PAP笔围绕载玻片的四个边缘，使染色溶液限制在圆形。
向幻灯片中添加阻塞缓冲区。确保所有组织切片用封闭缓冲液覆盖。在室温下孵育1小时。
吸出封闭缓冲液，加入在封闭缓冲液中稀释的一级抗体。在室温下孵育1小时（或4℃，过夜）。如果在染色中使用多于一种抗体，可以同时添加
用PBS清洗，3次，每次5分钟
加入在封闭缓冲液中稀释的2μL抗体，室温孵育1小时。如果在染色中使用多于一种抗体，可以同时添加2种< sup>抗体。不要用2 ^nd抗体过度曝光！
用PBS洗涤，3次，每次5分钟。
用Hoechst33258（最终浓度为1μg/ml，在PBS中）染色细胞核，在室温下10分钟。
用PBS清洗，3次，每次5分钟
安装在防褪色剂中。

食谱

阻塞缓冲区
0.2％triton X-100的PBS溶液 2％山羊血清（阻断血清应来自产生第二抗体的相同动物）

致谢

该协议改编自Ge等人（2009）和Mao等人（2010）中使用。

参考文献

Ge，X.，Frank，C.L.，Calderon de Anda，F.and Tsai，L.H。（2010）。 Hook3与PCM1相互作用以调节近中心材料装配和神经发生的时间。 Neuron 65（2）：191-203。
Mao，Y.，Ge，X.，Frank，CL，Madison，JM，Koehler，AN，Doud，MK，Tassa，C.，Berry，EM，Soda，T.，Singh，KK，Biechele，，TL，Moon，RT，Haggarty，SJ和Tsai，LH（2009）。 Cell 136（6）：1017-1031。