材料和试剂

发芽纸（76磅重重的种子发芽纸）（Anchor Paper Company）
120×120×17mm正方形塑料培养皿（USA Scientific，目录号：5668-8102）
铝箔
三折纸巾（von Drehle公司，目录号：548-W）
硅橡胶（食品级，高温，1/32"厚度，50A中等硬度）（McMaster-Carr，目录号：86045K131）
剃刀刀片
50ml锥形管
滤纸，级别40（Sigma-Aldrich，Whatman ，目录号：Z241261）
Parafilm（VWR International，Bemis，目录号：PM999）
蒸馏水
MS盐（Caisson Laboratories，目录号：MSP01-50LT）
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
氢氧化钾（1M水溶液）
琼脂（BD，Difco ^TM，目录号：214530）
甘露醇（PhytoTechnology Laboratories，目录号：M562）
玉米粒（B73自交系）
漂白剂（8.25％次氯酸钠溶液）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
70％（v/v）乙醇/水
Superglue（Krazy Glue，目录号：KG582）
控制琼脂培养基（参见配方）
处理琼脂培养基（见配方）
玉米核消毒液（见配方）

设备

玻璃瓶（500 ml以上容量）
pH计
高压灭菌器
层流罩
4℃冷藏室或冰箱
玻璃烧杯（500 ml以上容量）
热水浴或热水板
温度计
计时器
镊子
植物生长室（Percival，型号：CU41L4）
永久标记
微波
标尺
配备运行R或类似统计分析软件的计算机

软件

R或类似的统计分析软件（下载链接： https：//cloud.r-project .org/）

程序

琼脂培养基制备和种子电镀和琼脂夹心组件的材料灭菌
注意：这些步骤应在种子灭菌后不超过一天执行（见下文）。这些用品可以储存数周;建议提前准备好他们。
1. 准备控制和处理琼脂培养基
  注意：给定两种培养基类型（块侧/板侧：对照/对照，处理/对照，对照/处理和处理/处理 - 参见步骤C7以获得更多信息），可以构建四种可能的琼脂夹心条件。每种培养基类型的1L（15个平板）足以在每种条件下生长12株植物。这假设每个板使用两个植物，并且包括用于切割琼脂块的额外板（参见步骤C7）。所需的介质量将根据所需的样品大小和条件数量而变化。
2. 在121℃下，在湿循环中高压灭菌蒸馏水30分钟。 500毫升高压灭菌水足以对〜100粒种子灭菌注意：为了节省时间，在同一循环中使用高压灭菌蒸馏水和琼脂培养基。
3. 将发芽纸切成12×12厘米的正方形，并包裹在铝箔中。两个方块足以发芽10-12粒种子
4. 沿着三折褶皱折叠纸巾，沿短轴切成两半。用铝箔包装半张。每10-12株植物准备一张纸巾半张。
5. 将硅橡胶切成1.5 x 6厘米的条带，然后用铝箔包裹。每棵植物切两条。
6. 将滤纸切成〜4×4厘米正方形，并包裹在铝箔中。为每个植物切割一个正方形。
7. 包裹3-4片剃刀刀片在铝箔。
8. 高压灭菌纸张方格，纸巾半张，硅橡胶条，滤纸方格和剃刀刀片在121℃干燥循环20分钟。
  注意：不建议将这些物品与琼脂培养基和蒸馏水一起高压灭菌，应在湿循环中高压灭菌。
玉米粒的灭菌和发芽
1. 在50ml锥形管中的蒸馏水中浸泡种子4小时注意：使用足够的水，以完全覆盖所有的内核。为了易于处理，填充管不高于30毫升标记用内核。
2. 淡水。使用剃刀刀片，从确保胚胎和胚乳胚胎和胚乳没有损坏（图1A）删除尖端帽的内核。将内核放回50 ml锥形管中。
  注意：有时，内核的尖端帽可能太小或不便于访问，而不会损坏种子的其他部分。在这种情况下，可以跳过切除步骤。
3. 在温水（55-57℃）孵育谷粒5分钟。在将管放入水浴之前，将一些内容倒入含有内核的50ml锥形管中，以确保内核直接接触温水。
  注意：这可以使用热水浴，或通过用热板在玻璃烧杯中加热水来完成。此时不需要使用无菌水。
4. 滗析温水。用室温水冲洗种子一次。
5. 在玉米核消毒溶液中孵育谷粒20分钟。偶尔摇动管（每隔几分钟一次）。
6. 在层流罩中进行所有以下步骤。在放入发动机罩之前，用70％乙醇喷洒所有工作表面和材料。
7. 滗析玉米仁消毒液。废溶液可以在烧杯中收集
8. 用高压灭菌蒸馏水冲洗核5-7次。
9. 在高压灭菌的发芽纸上种子种子
10. 在生长室中在29℃，16小时光照/8小时黑暗循环下垂直培养平板2-3天。定位板材，使切割的颗粒末端指向重力
  
  图1.制备用于在方形板上的无菌发芽纸上萌发的玉米籽粒A.具有分别以黑色，青色和红色描绘的胚，胚乳和尖端帽的玉米籽粒。 B.在水中浸泡后含有发芽纸和纸巾的方形培养皿。 C.灭菌的玉米粒排列在发芽纸上。注意，内核的切割端远离已经折回的纸巾。 D.用封口膜密封后的发芽纸板。纸巾已经被折叠在谷粒上并且平滑在发芽纸上以保持谷粒在适当的位置。 E.电镀两天后发芽的幼苗
琼脂夹心组件
1. 在层流罩中进行所有步骤。在放入通风橱之前，用70％乙醇喷洒所有工作表面和设备。使用镊子操作材料，如琼脂，滤纸，硅橡胶，等。
2. 从发芽纸板中取出石蜡膜并折回纸巾。检查初生根已经出现并长到〜1厘米的长度（图1D）。
3. 取一块对照琼脂培养基，并使用高压灭菌剃刀刀片在板的一个边缘附近切割〜4×9厘米的矩形。删除并丢弃矩形中的琼脂。确保产生的孔是完全不含残留琼脂。该板将用于琼脂夹心的"板侧"（图2A）。
4. 将两个方格的滤纸放在琼脂板的矩形孔下方（图2B）。将纸张顺着琼脂平滑，以除去任何气泡。
5. 将硅橡胶条放在滤纸方格的左侧和右侧。将条带定位，使其刚好与滤纸重叠（图2C）。
6. 使用少量（1-2滴）超强力胶将橡胶胶粘到琼脂上（图2D）注意：在定位橡胶条时要小心，因为超胶粘键非常快，并且在粘合剂固化之后重新定位是有挑战性的。不要使用太多的superglue;虽然我们很少观察到对超高浓度植物的负面影响，如果根直接接触液体或固体胶，根部生长和发育会被强烈抑制。
7. 取另一块琼脂板，并使用高压灭菌剃刀刀片将其切成9个相等大小的正方形。这些将用于琼脂三明治的"块侧" 注意：此协议中包括可打印的模板，以帮助将琼脂块切割成正确的尺寸（图3）。
8. 在步骤C7中从板上取下两个块，并在每个块上放置一个滤纸方格。使用高压灭菌剃刀刀片切掉任何悬垂的滤纸（图2E）。放置块纸 - 下降到空的板盖以帮助切割滤纸
9. 将两个秧苗放置在来自步骤C6的琼脂板中，使得颗粒位于矩形孔中，并且主根尖位于滤纸的顶部（图2F）。避免直接用钳子接触主根或胚芽鞘。
10. 将琼脂块置于幼苗的主根上。
11. 用石蜡膜密封琼脂夹心板。
12. 如果幼苗从三明治中出来，请执行以下任一操作：
13. 用琼脂夹心条件（表示为"块侧/板侧"，例如"控制/对照"）标记板。
14. 使用永久性标记标记板背面主要根尖的位置。确保标记从板的另一侧可见（图2I）。
  
  图2.琼脂三明治的装配 A.去除琼脂的矩形部分后的平板侧琼脂培养基。 B.在板侧琼脂培养基上定位滤纸方格。 C.将硅橡胶条定位在滤纸方格上。 D.对一个硅橡胶条施加超强力胶。注意，在每个应用点只需要少量的胶水。 E.从单独的培养基板上切下的琼脂块。块被描述坐在有被应用的滤纸纸正方形的一个空的板盖子。 F.玉米幼苗在含有琼脂三明治的板侧的板中的位置。 G.在施加琼脂块之前，将超纯胶应用于硅橡胶条。 H.已经施用两个琼脂块之后的幼苗，并且用Parafilm密封板。 I.在板的背面的标记指示在琼脂夹层组件时主要根尖的位置
15. 对剩余的发芽幼苗重复上述步骤。确保使用所有可能的介质组合。
  注意：可能的组合（块侧/板侧）：控制/控制，治疗/控制，控制/治疗和治疗/治疗。
16. 在生长室中在29℃，16小时光照/8小时黑暗循环下垂直培养板4-5天，或者直到沿着三明治内的主根的长度出现侧根。
17. 如果任何谷粒没有发芽，或者它们的主根太短，不能放入琼脂三明治，一天后再检查一下。
从琼脂三明治中生长的幼苗侧根图案的量化
1. 从培养皿中取出石蜡膜并打开（图4A）
2. 使用永久标记，在主根上标记它们首先生长通过琼脂块（图4B，白色箭头）。
3. 使用镊子和刀片小心地取出琼脂块和滤纸。
4. 使用永久性标记标记根尖在夹层组装时（在板的背面上指示）的根部（图4B，黑色箭头）。测量并记录此标记与根部通过标尺生长经过琼脂块的标记之间的距离。
5. 计数出现在面向琼脂块的主根侧的侧根的数目（图4C和4D）。只计算在步骤D2和D4中形成的两个标记之间出现的侧根（图4C，白色和黑色箭头）。
  注意：如果用肉眼观察侧根很困难，可以使用低倍率显微镜辅助定量。
6. 小心提起主根和/或旋转幼苗，并计数在暴露于培养基中培养基的一侧出现的侧根数。
  注意：一些品种的玉米将在根部的暴露于空气的区域中积累花青素色素沉着（图4C和4D）。这可以用作暴露于块的根部的侧部和暴露于板中的介质的侧部之间的有用边界。
  
  图4.琼脂三明治和植物表型的拆解 A.夹心装配后五天（琼脂板去除）的琼脂三明治中的植物。 B.去除琼脂块和覆盖的滤纸方块之后的主根。标记已经放置在主根上，对应于夹层组装时根尖的位置（黑色箭头）和根生长经过琼脂块的点（白色箭头）。 C.主根的侧视图。横向根量化在主根上的两个标记之间进行（用B中的箭头表示）。两个侧根形成区由红色花青素色素化的条纹分开，所述红色花青素色素化响应于夹层物两侧之间的间隙中的空气暴露而形成。 D.主根不同区域的图示。横向根出现在暴露于琼脂培养基（块侧和板侧）的根的表面上，但不在标记有花青素的空气暴露区域（空气间隙）中。
7. 计数出现在根暴露于琼脂块和培养基之间的空气间隙的根侧的侧根的数目。只计算两个墨水标记之间的侧根，如步骤D5中所述。
  注意：对于大多数玉米品种，由于侧根水成熟，这个计数通常接近于0（Bao等人，2014）。
8. 将根部每侧的侧根数除以两个标记之间的距离（在步骤D4中记录），以计算以侧根/cm为单位的侧根密度。
9. 平均每个夹心条件下根部每侧的侧根密度
10. 对侧根密度值进行统计分析。下面简要描述实现这一点的步骤。此协议提供了一个使用R（R Core Team，2015）编写的示例脚本（补充文件 1 和 2 ）。

数据分析

关于不同琼脂夹心条件下的平均侧根密度的实例图，参见图6A。表1包含在R中进行的ANOVA的输出。图6B总结了在观察到显着顺式条件：ANOVA中的反条件相互作用项之后的事后检验的结果。

表1. R方差分析的输出顺式条件对侧根密度有显着影响（

0.05），表明治疗的效果不依赖于在琼脂夹心（块或板琼脂培养基）。 numDF和denDF分别表示分子和分母自由度

图6.代表性数据和统计分析 A.在4个琼脂夹心条件下用对照或甘露醇琼脂培养基处理玉米幼苗。显示了根部每侧的平均侧根密度。在每种条件下，气隙密度为0。误差棒=标准误差，每种条件n = 6株。 B.事后测试的数据摘要。由于顺式条件：反式条件项对横向根密度有显着影响，并且夹心（块对板）侧没有显着影响（参见表1），不同处理类别之间的所有成对比较使用R中的"multcomp"包执行。类似的组用相同的字母表示（对于显着差异， P <0.05）。对于对照培养基的反应与在根的另一侧上的处理无关，表明根部局部地响应于该条件。相反，对甘露醇的反应根据是否用甘露醇或对照培养基处理根的另一侧而不同，表明甘露醇可对发育具有系统效应。误差线=标准误差，n =每个类别12个观察值。

笔记

琼脂夹心程序改造自用于水稻幼苗的程序（Karahara等人，2012）。
我们发现，结合热处理和漂白剂孵化是玉米核消毒的最有效的方法。热处理方案改编自Daniels（1983）。本文所述的灭菌和种子发芽条件已经针对玉米籽粒进行了优化。涉及其它植物物种的研究可能需要对这些步骤进行修改以确保足够的不育性和发芽率（例如，遗漏热处理，在乙醇中添加孵育，和/或使用不同类型的发芽培养基以支持早期幼苗的生长）。
该方法广泛适用于查看可以施加在凝胶介质中的基本上任何化学试剂的梯度。虽然我们主要集中在通过在处理侧应用渗透剂（例如，甘露醇或聚乙二醇）的水可用性的差异，但也可以研究不同浓度的营养物，例如硝酸盐和磷酸盐。
将这种技术应用于其他植物物种主要受到主根直径的限制。根直径必须大于或等于用于分离夹层中的两种琼脂介质的硅橡胶的厚度。如果根部比夹层结构的两侧之间的间隙薄，则不会发生与两种介质条件的充分接触。较窄的材料可以用作两种琼脂培养基之间的间隔物。然而，这增加了在两个琼脂表面之间形成水膜的可能性，这将逐渐消耗穿过夹心的任何化学梯度。
如果夹心两侧的两种介质彼此直接接触，水溶性化学品浓度的任何差异将随时间平衡。为了在检查不同水势的影响时控制这种可能性，我们使用蒸汽压渗透计测量夹心的任一侧上的介质的水势，以证明其在实验期间是稳定的（Bao等人al 。，2014）。对其他化学梯度的研究可能需要替代的质量控制方法
在我们的手中，暴露于施加的琼脂块的根的一侧偶尔具有比另一侧更少的侧根，即使当培养基组成相同时。我们将这归因于块与根的不充分接触，如块侧的增加的花青素积累（玉米主根的空气暴露的指标）所证明的。 "方差分析"方法在方差分析测试中的显着影响也可以帮助确定何时这发生。这可以通过在每个夹心条件下增加样品大小以及在装配琼脂三明治时更加小心来补偿。
使用滤纸将琼脂与根分离，以防止根尖生长到夹层的任一侧。滤纸可以省略，但是根部渗入琼脂培养基的可能性增加。应当额外注意，以确保三明治两侧的两种类型的琼脂不会相互接触（见注5）。

食谱

控制琼脂培养基
1. 1×MS盐+ 0.5g/L MES水合物
2. 使用氢氧化钾溶液将pH调节至5.7
3. 在湿循环中在121℃下加入2％（w/v）琼脂和高压灭菌器30分钟
4. 冷却后，在层流罩中将培养基倒入塑料板中，65ml /板。不要丢弃用于运输板的塑料套管。体积可以使用无菌的50ml锥形管测量
5. 培养基凝固后，将平板放在装有平板的塑料套中，并在4℃下倒置贮存。
注意：琼脂浓度低于2％w/v的培养基将很难切成块，并在装配琼脂三明治时进行操作。
治疗琼脂培养基

1/2xMS盐+ 0.5g/L MES水合物+ 220mM甘露醇
使用氢氧化钾溶液将pH调节至5.7
在121℃下加入2％（w/v）琼脂和高压灭菌器30分钟
将培养基倒入塑料板中，如上所述存放于对照琼脂培养基上

玉米核消毒液
20％（v/v）漂白剂+ 0.01％（v/v）吐温20的蒸馏水中每次灭菌前立即准备新鲜。 15 ml足以满足30颗内核。

致谢

本材料基于国家科学基金会研究生研究奖学金资助号DGE-1147470支持的工作。在本材料中表达的任何意见，发现，结论或建议是作者的，不一定反映国家科学基金会的意见。

参考文献

Bao et al。，2008; Wang et al。，2008; Wang et al。，2008; Wang，et al。 MJ和Dinneny，JR（2014）。植物根使用图案化机制将侧根分支定位于可用水。美国国家科学院院刊111（25）：9319-9324。

Daniels，BA（1983）。从玉米种子中消除 Fusarium moniliforme 。植物病 67（6）：609-611。

Hothorn，T.，Bretz，F.和Westfall，P.（2008）。一般参数模型中的同时推理。 Biom J 50（3）：346-363。

Karahara，I.，Umemura，K.，Soga，Y.，Akai，Y.，Bando，T.，Ito，Y.，Tamaoki，D.，Uesugi，K.，Abe，J.，Yamauchi， Mineyuki，Y。（2012）。渗透依赖性使用"三明治"方法和X射线计算机断层摄影术在水稻的主根中促进不同水平的气胀形成。 Ann Bot 110（2）：503-509。

Pinheiro，J.，Bates，D.，DebRoy，S.，Sarkar，D.，Heisterkamp，S. Willigen，BV和R-Core（2016）。 nlme：线性和非线性混合效应模型 R包版本 3.1-128 。

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