材料和试剂

液体阻滞剂，"PAP pen"（Science Services，目录号：N71310）
显微镜载玻片（例如，Superfrost; Carl Roth，目录号：1879.1）
双面胶带（例如，reichelt elektronik，Tesa Sande，目录号：05338）
注射器针（例如，Terumo，目录号：NN-2425R; VWR International，目录号：HSWA4710005525）
显微镜盖玻片（，例如，Carl Roth，目录号：H874.2）
移液管吸头（200μl）
剃刀刀片（，VWR International，Darmstadt，目录号：233-5224）
新鲜拟南芥植物材料（生长条件如Babu等人在2013年描述的）。</b>
去离子水
10％甘油（例如，Sigma-Aldrich，目录号：49782）
1％（v/v）DMSO（例如，Carl Roth，目录号：7029.2）
0.05％（w/v）Triton-X 100（例如，Carl Roth，目录号：3051.2）
3.75％（w/v）多聚甲醛（例如，Carl Roth，目录号：0335.2）
PBS缓冲液（pH 7.4）（例如，Carl Roth，目录号：9143.2）
任选的：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（例如，Carl Roth，目录号：6335.1）
SR2200染色溶液（见配方）
注意：SR2200可订购自：Renaissance Chemicals Ltd，Unit 1 Blackwood Hall Business Park，North Duffield，Selby，UK。联系人：Howard Weaver， enquiries@renchem.co.uk /a> 。

设备

镊子
双目（例如，ZEISS，型号：Stemi 2000）
可调移液管20-200μl（例如，Gilson Pipetman-neo P200N; Carl Roth，目录号：HY87.1）
真空泵（，例如，Vacuubrand PC2004 Vario）
真空室（例如，Kartell Labware 554）
具有用于DAPI成像（例如，Leica TCS SP8）的405nm激光和标准滤光片组的共聚焦激光扫描显微镜或如果需要使用DAPI双重染色的光谱检测器（例如。，Zeiss LSM780NLO 与32通道GaAsP阵列）

程序

拟南芥胚胎的制备和染色（图1）
1. 使用PAP笔，在构成20mm×20mm面积的显微镜载玻片上标记一个正方形。
2. 向标记的正方形的中心加入60μl文艺复兴染色溶液
3. 用镊子取出适当发育阶段的长角果，并转移到显微镜载玻片上的双面胶带。
4. 步骤A5-8将在立体显微镜/双目镜下进行。
5. 用注射器针头（视频1）沿着隔膜切开长角果。
  
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  strong>视频1.剖析长角果以收集胚珠
6. 轻轻地将心皮拉向侧边。
7. 可以用注射器针尖取出胚珠，并转移到显微镜载玻片上的染色溶液中
8. 小心地覆盖胚珠，盖玻片避免气泡。
9. 通过用移液管尖端在盖玻片上施加压力挤出胚芽从种子挤出，直到胚珠破裂。缓慢释放压力，以避免可能从胚胎中断悬吊器结构的湍流（视频2）。
10. 胚胎可以立即通过共聚焦显微镜成像
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  strong>视频2.通过对盖玻片施加压力释放胚泡解剖胚珠
  
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  图1.拟南芥胚胎的制备和染色。A.使用PAP笔，在显微镜载玻片上标记20×20mm正方形。 B.用60μlSR2200染色溶液填充正方形。 C.将适当发育阶段的长角果转移到显微镜载玻片上的双面胶带上。 D.使用注射器针头的尖端将长角果切开。 E.收集胚珠并转移到染色溶液中。 F.用盖玻片小心地覆盖胚珠后，通过用移液管尖端轻轻地向盖玻片施加压力将胚胎挤出胚珠。
年轻胚珠和花粉管的制备和染色
1. 按照胚胎制备方案的步骤A1-7。
2. 未受精或新受精的胚珠（授粉后至多2天）以及整个长角果组织可以转移到显微镜载玻片上的染色溶液中。对于年轻的胚珠，最容易将整个复制品和隔膜与附着的胚珠一起转移
3. 小心地将显微镜载片转移到真空室，并施加软真空（80毫巴）5分钟
4. 用移液管除去SR2200染色溶液，但不摘取染色的植物组织
5. 加入150μl水。
6. 使用软真空（80 mbar）5分钟。
7. 用移液管小心取出水，不要取出植物组织。
8. 加入50μl10％甘油溶液
9. 用盖玻片轻轻盖住样品，不要夹住气泡。
10. 样品可立即用于共聚焦显微镜
根组织的制备和染色（图2）

图2.拟南芥根的制备和染色。将5天龄的幼苗放置在准备的显微镜载玻片上，用手术刀或剃刀在下胚轴上切割刀片用SR2200溶液染色; b。在静止中心细胞中的pWOX5 :: erGFP 表达（绿色）（Xu等人，2006）。 SR2200染色为灰色。比例尺=50μm。
1. 使用PAP笔，在构成20mm×20mm面积的显微镜载玻片上标记一个正方形。
2. 将4-5个幼苗转移到物体上，并将它们放置在正方形内，使得根部都在一个方向上定向
3. 拿起剃刀刀片，水平切割下胚轴。
4. 加入100μlSR2200染色溶液
5. 使用软真空（80 mbar）5分钟。
6. 小心地用移液管除去染色溶液而不接触根
7. 加入100μl水。
8. 使用软真空（80 mbar）5分钟。
9. 小心地用移液管移除水，而不接触根
10. 加入50μl10％甘油溶液
11. 用盖玻片轻轻盖住样品。
12. 样品可立即用于共聚焦显微镜
显微镜
SR2200具有350 nm左右的激发最大值，但可以成功使用405 nm激光线。 SR2200给出非常明亮的荧光信号，因此只需要非常有限的激光功率。可以使用为DAPI成像设计的通常可用的过滤器组来检测发射。
当需要用SR2200和DAPI双染色时，与更明亮的SR2200荧光相比，在单个通道中同时成像两种染料通常导致非常弱的DAPI信号。因此，它是更合适的方法，例如用检测器阵列记录荧光信号的光谱信息，并通过光谱解混合将信号分离成单个通道。我们使用具有32通道检测器阵列的Zeiss LSM780显微镜与ZEN软件的在线指纹功能组合，并且应用单独预先记录的两种染料的光谱以及背景荧光。与SR2200的信号相比，通过调整各个通道的数字增益以获得可比较的信号强度，DAPI通道的信号增加约18倍。染色程序如上所述，在染色溶液中加入DAPI

代表数据

图3.SR2200染色的拟南芥胚胎的代表性图像表达pNMA> NLS-tdtomato（红色）的A.8-细胞胚胎（Babu等人，2013）。 B.表达Q0990> erGFP（绿色）的晚期心脏期胚胎（Weijers等人，2006）。 SR2200信号为灰色。 C.用SR2200和DAPI双染色的2细胞胚胎的最大投影。通过光谱解混合（Musielak等人，2015），将细胞核中的DAPI信号（青色）与细胞壁中的SR2200信号（灰色）分离。比例尺=20μm。

食谱

SR2200染色溶液
注意：供应商的库存解决方案被视为100％。
0.1％（v/v）SR2200
1％（v/v）DMSO 0.05％（w/v）Triton-X 100
5％（w/v）甘油 3.75％（w/v）多聚甲醛
在PBS缓冲液（pH7.4）中可选：2μg/ml DAPI
为了简化制备，我们首先通过将PFA粉末溶解在温和加热的1×PBS缓冲液（pH 7.4）中来制备4％（w/v）多聚甲醛（PFA）溶液。冷却PFA溶液后，我们加入剩余的成分以补足最终体积。染色溶液可以在-20℃下以1ml等分试样储存。始终使用新鲜等分试样进行染色。

致谢

该方案改编自以前发表的Musielak等人的研究。（2015）。我们要感谢Christian Liebig和Aurora Panzera的发展生物学MPI的显微镜设备的技术援助和支持，Agnes Henschen和Laura Schenkel帮助建立初始染色方案。我们集团的研究由德国科学基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft-DFG：SFB1101/B01至M.B.）和马克斯普朗克学会支持。

参考文献

Babu，Y.，Musielak，T.，Henschen，A.和Bayer，M。（2013）。悬浮体长度决定胚胎在拟南芥中的发育进程。 162（3）：1448-1458 。

Musielak，TJ，Schenkel，L.，Kolb，M.，Henschen，A.和Bayer，M.（2015）。研究植物繁殖的简单而多功能的细胞壁染色方案。植物繁殖 28（3-4）

Weijers，D.，Schlereth，A.，Ehrismann，JS，Schwank，G.，Kientz，M。和Jurgens，G.（2006）。生长素在拟南芥胚胎发生中触发细胞规格的瞬时局部信号传导。 Dev Cell em> 10（2）：265-270

Xu，J.，Hofhuis，H.，Heidstra，R.，Sauer，M.，Friml，J。和Scheres，B.（2006）。用于植物再生的分子框架。 311（5759）：385-388。