材料和试剂

剃刀刀片，单边，9号（0.22mm）（VWR国际，目录号：55411-050）
Greiner CELLSTAR 24孔平底板（Sigma-Aldrich，目录号：M8812）
96孔圆底板（Corning，目录号：3788）
Durapore胶带（3M，目录号：1538-1）
Superfrost TM和ColorFrost TM TM载玻片（25×75×1.0mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4951PLUS4 ）
Coverslips，No.1.5（ProSciTech，目录号：G425-2460）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A6013-250G）
Vetbond组织粘合剂（3M，目录号：1469SB）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
蛋白质块（Dako，目录号：X0909）
正常驴血清（NDS）（Jackson ImmunoResearch，目录号：017-000-121）
长寿黄金抗衰退试剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36930）
抗体[例如，pacific blue anti-B220，RA3-6B2（Biolegend，目录号：103230）; 山羊抗CD69（R& D Systems，目录号：AF2386）]
高碘酸钠（NaIO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：311448）
正磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·H 2 O）（一碱价）（VWR，目录号：97062-412） br />
无水（Na 2 HPO 4）（二价）（Ajax Finechem，目录号：621-500G）的二 - 正磷酸氢钠
L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5501）
来自猪皮的明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890-100G）
用于分子生物学的甘油（≥99％）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
16％多聚甲醛水溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：30525-89-4）
高碘酸 - 赖氨酸 - 多聚甲醛（PLP）固定剂（参见配方）
P缓冲区（参见配方）
L-赖氨酸（参见配方）
5％明胶/甘油混合物（见配方）

设备

Vibratome（Leica，型号：VT1200S）
Dumont No.5镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-10）
剪刀，直，锋利（Roboz，目录号：RS-6752）
软毛刷漆刷（，例如：2/0）
具有可调相干变色龙Ti：Sa激光器（ZEISS，型号：LSM 710NLO）的显微镜
注意：此产品已停产（可更换产品，例如ZEISS，型号：LSM 800）。
称量1克的秤
微波

软件

Imaris，Bitplane（ http://www.bitplane.com/）

程序

收获淋巴结（LN），并置于2 ml PLP或2％多聚甲醛（PFA）在4°C固定。
注意：

该步骤是可选的，但对于保持细胞形态至关重要，但可能损害某些抗体染色。我们测试的一个实例是抗-XCR1（克隆：ZET），其中固定消除染色。 PLP优选用于保持细胞细胞形态，例如细胞树突。
涉及动物的所有程序必须根据经过适当培训和认证的人员的认可机构，地区或国家协议（如适用）进行。

固定后（对于小LN，为4-6小时，对于较大的组织，例如炎症后肿胀的LN，达12小时），将组织转移到2ml冷PBS中并保持在冰上。
将组织嵌入琼脂糖凝胶中：

将温热的2％琼脂糖在PBS（煮沸，然后在流动的自来水下冷却，直到温暖接触）倒入24孔板的孔中;
将组织装入装有温热琼脂糖的孔中并按所需方向，图1（每个LN应接触孔底部，并且随后平行于该平面切片）;
确保平板是平的，留在冰上，让琼脂糖凝固

图1.将琼脂糖凝胶中的LN包埋。将温热的琼脂糖倒入孔中，将LN包埋在琼脂糖中并调整到所需的方向（左）。允许琼脂糖凝固（右）。

同时，按照制造商的说明启动振动筛并校准切割刀片。准备冰浴，并用冷PBS填充缓冲液托盘，如图2所示

图2.设置vibratome 。插入刀片并校准，准备冰浴，并用冷盐水缓冲液填充缓冲盘。
用一把镊子取出含有LN的琼脂糖块，用刀片小心地修剪成长方体形状，如图3所示。
将1-2条3M Durapore胶带贴在样品架上。使用一滴Vetbond粘合剂（图3，右）将修剪好的LN /琼脂糖块固定在样品架上（LN在块顶部附近）。
注：优选由制造商推荐的氰基丙烯酸酯胶。但是，如果使用Vetbond，请等待〜1分钟后粘贴组织块以使胶水干燥。

图3.安装LN /琼脂糖块。从孔（左）中取出集琼脂糖凝胶，用刀片修剪成长方体形状（中间），并将块安装到样品架上，少量胶水（右）。
将样品支架安装到vibratome上进行切割。 LN应该对齐，使其纵向剖分，我们发现组织质量更好保存（图4）
设置vibratome确保适当的切割速度和厚度。通常，我们使用〜0.03 mm/s刀片速度，〜1.6 mm幅度，以及〜200-250μm厚度，以最好地保护LN结构完整性。
首先在琼脂糖表面上方的振动叶片，使用刷子作为指导，并开始通过自动单一或连续切片切割。丢弃第一个切片。
将切片（用5号钳和软毛刷）转移到填充有冷PBS的96孔圆底板中的孔中，图4.特别小心只夹住切片的琼脂糖部分，破坏LN组织

图4.处理vibratome切片。一旦LN /琼脂糖切片被切割（左），使用一对细镊子和刷子从缓冲盘（中间）检索切片，离开在冷PBS中。作为参考，切片应显得相对完整，对组织的破坏最小（右图）
通过用抗体染色的连续步骤中使用的试剂填充每一行来制备用于抗体染色的96孔圆底板（图5）：
行1：冷PBS（其中LN切片最初放置）
第2行：蛋白质块
第3行：第一抗体（〜70μl每孔）
第4行：PBS（Wash＃1）
第5行：PBS（清洗＃2）
第6行：第二抗体（〜70μl/孔）
第7行：PBS（Wash＃1）
行8：PBS（清洗＃2）
在每个孵育步骤后，将LN切片转移到每列
在蛋白质块中孵育1-2小时
转移到含有一抗（稀释于2.5％NDS）的孔中，并在4℃下孵育8小时或过夜。
注意：我们测试了太平洋蓝结合的抗B220（稀释1:200）和未结合的抗CD69（稀释1:50）。应注意，每个抗体批次应单独滴定以获得最佳结果。
转移到第一个洗涤缓冲液（PBS）孔20-30分钟，然后第二个孔含有洗涤缓冲液（PBS）。
转移到含有二抗（在2.5％NDS中稀释）的孔中，并在4℃下孵育8小时或过夜。
转移到第一个洗涤缓冲液（PBS）孔20分钟，然后第二个孔含有洗涤缓冲液（PBS）

图5.抗体染色的平板设置每个孔含有一个LN切片，其沿每个柱转移以进行抗体标记和洗涤步骤。
将LN切片放在玻璃显微镜载玻片上（每片至多4个LN切片）。按所需方向排列。
使用PBS中的5％明胶/甘油作为安装介质，并仔细地将盖玻片覆盖在组织上，使边缘被密封。
幻灯片现在可以进行双光子成像：
采集参数不同，取决于所需的质量和荧光团配置（参见注释）。
在我们的实验中，我们使用：Zeiss LSM710 NLO与可调相干变色龙Ti：Sa激光蔡司20x/1.0 NA水浸镜头。
分辨率：512 x 512
切片间隔：2.5μm
缩放：〜1.5x
激光功率和增益设置的深度调整校正，以减少组织的过度激光激发，从而导致光漂白和光毒性。
使用Zeiss Zen软件的瓦片扫描功能获取整个LN横截面。示例如图6所示。
可以在专用图像处理软件（例如，Bitplane Imaris）上执行采集后处理，以允许对单元（点特征函数）进行定量和输出统计量。此外，Imaris XTension函数或定制的MATLAB脚本可用于进一步分析。

代表数据

图6.使用双光子显微 scopy获得的LN切片的实例图像示出了由CellTrace紫罗兰标记的CD4T细胞填充的150μm切片的小鼠腹股沟淋巴结LN绿色），CellTracker深红色标记的CD8 T细胞（白色）和TRITC标记的迁移性DC（红色）。根据制造商方案（Thermo Fisher Scienctific）用CellTrace或CellTracker染料标记细胞。然后将LN切片用Pacific Blue抗-B220（蓝色）染色。另外在蓝色是描绘通过二次谐波发生照明的LN胶囊的胶原。使用Zeiss LSM710NLO在双波长（800nm用于激发CellTrace紫，CellTracker深红和太平洋蓝，和880nm用于TRITC激发）和512×512分辨率的8×4瓦片中获得图像，用于3×1.5mm LN横截面。然后使用Imaris（位平面）处理图像。使用Imaris XTension中的通道算术函数去除自发荧光和光谱交叉。

笔记

在较慢的切割速度下可获得最佳的组织质量。我们发现0.03毫米/秒切片组织与最小的破坏。然而，如果认为可接受，则可以增加切割速度以节省时间
Prolong Gold固定介质也可以与明胶/甘油结合使用，以利用它们的防褪色性能：在组织切片的顶部放置小滴的长期黄金，和明胶/甘油混合在幻灯片的空白区域。这将允许Prolong Gold覆盖组织切片，同时允许明胶/甘油混合物有效地密封载玻片的边缘。
虽然共聚焦显微镜可以用于获取vibratome切片的图像（我们已达到40微米的深度），它不能成像足够深，以充分利用切片的厚度。双光子显微镜适用于成像高达150-200微米的深度
取决于荧光团组合，双重双光子激发波长可以用于获得具有不同激发截面的荧光（例如，对AlexaFluor染料使用800nm，对于EGFP/DsRed使用920nm）。
某些荧光团被双光子激发快速漂白，应该仔细考虑。例如，我们发现缀合AlexaFluor 647的抗体是这种目的的不良选择。相比之下，AlexaFluor 594对于双光子成像是相对光稳定的。

食谱

高碘酸 - 赖氨酸 - 多聚甲醛固定剂
对于10ml溶液：
3.75ml 0.1M P-缓冲液（pH7.4） 3.75ml 0.2M L-赖氨酸（pH7.4） 0.0213g NaIO 4
2.5ml 4％多聚甲醛
注意：每次使用时都要新鲜准备。
P-缓冲液，0.1M/mL 对于200ml溶液：
19ml 0.2M NaH 2 PO 4（一碱价）
81ml 0.2M Na 2 HPO 4（二价）
100ml H 2 O 2 / 将pH调节至7.4
存储在4°C
L-赖氨酸，0.2μM/mL 对于100ml溶液：
2.92g L-赖氨酸 100ml 0.1M P-缓冲液
将pH调节至7.4
存储在4°C
5％明胶/甘油混合物
对于20ml溶液：
1克来自猪皮的明胶
1 ml甘油用于分子生物学，≥99％
20ml PBS
通过倒置管混合并置于37℃水浴中以防止凝胶硬化
注意：每次使用时都会重新更新。

致谢

该方案改编自我们的出版物（Hor等人，2015）。这项工作得到国家卫生和医学研究委员会和澳大利亚研究委员会的支持。

参考文献

Hor，JL，Whitney，PG，Zaid，A.，Brooks，AG，Heath，WRand Mueller，SN（2015）。与树突状细胞亚群的时空不同的相互作用促进CD4 ⁺和CD8 ⁺ T细胞激活到局部病毒感染。免疫 43（3）：554-565。