材料和试剂

5ml注射器（BD，目录号：309646）
25 G x1 ½针（BD，目录号：305127）
锥形管（15ml）（Coring，Falcon ，目录号：352095）
C57BL/6小鼠，通常为8-12周龄（雄性或雌性）
1×10 5 pASC-GFP颗粒，其由稳定或瞬时表达HEK293细胞产生并通过流式细胞术分选（Fernandes-Alnemri等人，2007; Fernandes-Alnemri 和Alnemri，2008）
1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，目录号：21-030-CV）
HEPES
KOH
氯化镁（MgCl 2）
EGTA
CHAPS
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
IL-1βELISA试剂盒（BD，目录号：559603）
裂解缓冲液（见配方）

设备

离心机
荧光显微镜
流式细胞术
外科器械如镊子和剪刀
生物安全柜

程序

如先前所述，分离用ASC-GFP稳定或瞬时转染的10 7个HEK293细胞的pASC-GFP颗粒（Fernandes-Alnemri等人，2007; Fernandes-Alnemri和Alnemri ，2008;Martín-Sánchez等人，2015）或流式细胞术。
从细胞中取出培养基，添加DPBS并轻轻刮除细胞。在1,500×g下旋转细胞5分钟。弃去上清液。
通过在补充有蛋白酶抑制剂的20mM HEPES-KOH，pH 7.5,5mM MgCl 2，0.5mM EGTA，0.1％CHAPS中的细胞沉淀的低渗裂解制备总细胞裂解物。使用带有25 G针头的注射器通过注射几次裂解细胞。离心细胞裂解物全速以获得细胞裂解物上清液
如前所述（Fernandes-Alnemri等人，2007; Fernandes-Alnemri和Alnemri，2008）通过在37℃下孵育细胞裂解物上清液诱导ASC-GFP的聚集30分钟。回收的ASC-GFP颗粒的典型量为2×10 5至4×10 5个/百万细胞。
加入少量上清液到显微镜载玻片，以确认ASC聚合成1-3微米聚集体通过荧光显微镜使用标准的GFP激发/发射滤光片集（激发：484纳米;发射：507纳米）（图1）。 />
基于前向散射与侧向散射通过对小颗粒进行门控，通过流式细胞术分选ASC-GFP颗粒（1-2μm）。接下来通过门控FITC阳性颗粒开始。随后通过荧光显微镜确认ASC-GFP颗粒（图1）。颗粒可以在4℃保存一年。
腹膜内注射1×10 5 pASC-GFP颗粒或对照小鼠相同体积的DPBS（注射体积约200μl）。
4小时后处死小鼠，切开皮肤并暴露腹膜壁（视频1）
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视频1.腹膜灌洗。视频显示如何在注射pASC-GFP颗粒后通过ELISA测量IL-1β来清洗腹膜腔。

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将4ml DPBS注入腹膜腔。
摇动鼠标以清洗腹膜腔。
使用注射器通过逐渐拔出插入物来恢复注射的DPBS
取出针头，向锥形管中加入内容物。
以1,200×g 旋转细胞5分钟。
将上清转移到新鲜的锥形管中，并通过ELISA测量IL-1β。典型的IL-1β浓度高达2ng/ml，并且在我们先前的出版物（de Almeida等人，2015）中显示了代表性的结果。

代表数据

来自稳定的表达ASC-GFP的HEK293细胞的总细胞裂解物在诱导ASC聚合后通过流式细胞术进行GFP分选，并且通过荧光显微镜分析对照（Ctrl）和含ASC-GFP（pASC）的级分。/strong> HEK293细胞裂解物用作阴性对照。

笔记

ASC-GFP颗粒应避光使用。

食谱

裂解缓冲液
20mM HEPES-KOH，pH 7.5 5mM MgCl 2/
0.5mM EGTA 0.1％CHAPS
蛋白酶抑制剂

致谢

该方案改编自以前发表的研究（de Almeida等人，2015）。这项工作由国家卫生研究院（AI099009，AI120625，AI120618和AR064349到C.S.，AR066739到A.D.，AI120625和AI120618到C.S.和A.D.，T32AR007611到L.d.A.和美国心脏协会13GRNT17110117到C.S.）支持。

References

Baroja-Mazo, A., Martin-Sanchez, F., Gomez, A. I., Martinez, C. M., Amores-Iniesta, J., Compan, V., Barbera-Cremades, M., Yague, J., Ruiz-Ortiz, E., Anton, J., Bujan, S., Couillin, I., Brough, D., Arostegui, J. I. and Pelegrin, P. (2014). The NLRP3 inflammasome is released as a particulate danger signal that amplifies the inflammatory response. Nat Immunol 15(8): 738-748.
Bondar, V. S. and Puzyr, A. P. (2000). Use of nanodiamond particles for rapid isolation of recombinant apoobelin from Escherichia coli. Dokl Biochem 373(1-6): 129-131.
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de Almeida，L.，Khare，S.，Misharin，AV，Patel，R.，Ratsimandresy，RA，Wallin，MC，Perlman，H.，Greaves，DR，Hoffman，HM，Dorfleutner，A.and Stehlik，（2015）。 PYRIN仅结构域蛋白POP1抑制炎症小体组装和改善炎性疾病。免疫 43（2）：264-276。
Fernandes-Alnemri，T.，Alnemri，ES（2008）。衔接子ASC具有增殖炎症的细胞外和"朊病毒"活性。 Nat Immunol 15（8）：727-737 。

Martín-Sánchez，F.，Gómez，AI和Pelegrín，P.（2015）。重组ASC和NLRP3的颗粒的分离。生物协议 5（10）：e1480。

Ratsimandresy，RA，Dorfleutner，A.和Stehlik，C.（2013）。含有PYRIN结构域的模式识别受体的更新：从免疫到病理。前免疫 4：440。