材料和试剂

50ml锥形管（Coring，Falcon ，目录号：352070）
Cytodex-3珠（GE Healthcare，Amersham Pharmacia Biotech，目录号：17-0485-01）
吸气器
FACS管（5ml）（Coring，Falcon ，目录号：352063）
15ml锥形管（Coring，Falcon ，目录号：352099）
1.5ml离心管
24孔板（Coring，Falcon ，目录号：351147）
0.22μm过滤器（VWR，目录号：28145-501）
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和HUVEC完全培养基（Lonza，目录号：C2517A和CC3162）
注意：最好在2-4节。
正常人肺成纤维细胞（NHLF）（Lonza，目录号：CC2512）
Sigmacote渗硅试剂（Sigma-Aldrich，目录号：SL2-25ML）
蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup> TM，目录号：15230-162）
DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14040-141）
来自牛血浆的纤维蛋白原（Sigma-Aldrich，目录号：F8630-1G）
来自牛血浆的凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：T3399-1KU）
注意：此产品已停产。
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153-10MG）
Clonetics EGM-2子弹试剂盒（Lonza，目录号：CC3162）
胰蛋白酶/EDTA（0.025％胰蛋白酶/0.75mM EDTA）（EMD Millipore，目录号：SM-2004-C）
Aflibercept（VEGF-Trap）（Regeneron Pharmaceuticals）
Dll4阻断单克隆抗体（Dll4 MAB）（Regeneron Pharmaceuticals）
大鼠抗人整联蛋白α-6抗体GoH3（BD，BD Pharmingen ，目录号：555734）
多聚甲醛（PFA）（16％）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-100ML）
鬼笔环肽 - 四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（Phalloidin-TRITC）（Sigma-Aldrich，目录号：P1951-.1MG）
FGM-2子弹试剂盒（Lonza，目录号：CC3132）
Hoechst 33258，五水合物，双 - 苯甲酰亚胺（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：H3569）
纤维蛋白原溶液（参见配方）
凝血酶储备溶液（见配方）
抑肽酶原液（参见配方）

设备

硅化玻璃瓶（Corning，PYREX ，目录号：1395-100）
层流罩
水浴（PolyScience，目录号：WB05A11B）
T25烧瓶（Corning，目录号：430639）
离心机
孵化器
P1000移液器
24孔玻璃底部感光板（Greiner Bio One，目录号：662892）
细胞计数器（Nexcelom BioScience，型号：Cellometer Auto 1000）
显微镜（Nikon，型号：Eclipse Ti-S）
ImageXpress ^{？MICRO XL}（Molecular Devices）

软件

MetaXpress（Molecular Devices）
注意：Molecular Devices的MetaXpress软件（MX）经过优化，可与ImageXpress ^MICRO成像系统配合使用。 MX用于控制图像采集和执行图像分析。在FBA图像采集和分析中使用的MX的必要特征是：1）图像采集：基于激光的自动对焦，Z堆叠采集; 2）图像分析："管形成"图像分析应用模块，交互式自定义模块。

程序

试剂的制备
1. 硅化和灭菌
  1. 加入5毫升的Sigmacote清洗玻璃瓶，以防止珠子粘在玻璃器皿。
  2. 旋转容器或玻璃器皿，以确保Sigmacote覆盖玻璃瓶的整个表面。
  3. 从玻璃器皿吸出过量的Sigmacote，并允许在层流罩中风干
  4. 在去离子组织培养级水中彻底清洗玻璃器皿。建议至少进行两次洗涤。
  5. 通过高压灭菌器灭菌玻璃器皿。
  注意：一旦玻璃器皿已经硅化，在每次使用之前不必进行处理。
2. Cytodex珠准备
3. 纤维蛋白原溶液制备（参见配方）
4. 凝血酶储备液制备（参见配方）
5. 抑肽酶原液制备（见配方）
细胞的制备
在使用前1天将HUVEC和成纤维细胞的生长培养基更换为EGM-2培养基。对于HUVEC，在珠粒前一天将培养基更换为EGM-2。对于成纤维细胞，在嵌入纤维蛋白前一天将FGM-2培养基切换到EGM-2。珠粒需要每个珠约400个HUVEC。在24孔板的每孔中使用20,000个成纤维细胞
用HUVEC（第1天）包被珠子
1. 将温热的EGM-2培养基置于37℃的水浴中
2. Trypsinize HUVECs应该是80％汇合。用PBS洗涤细胞，然后加入3毫升胰蛋白酶。使胰蛋白酶保留在细胞上约2分钟或直到细胞开始从烧瓶中分离。加入EGM-2培养基以中和胰蛋白酶并使总体积达到10ml。在离心机中旋转细胞，用吸气器除去上清液，并将细胞浓度调节至2×10 6个细胞/ml。
3. 在无菌条件下，将170μl珠溶液（储备浓度：30,000个珠/ml）置于FACS管中。这应该?5,000珠。使珠沉降（不要离心），吸出上清液，并在2ml温热的EGM-2培养基中洗涤珠。使用移液管移除介质，添加新鲜温暖的媒体，总体积为2毫升
4. 向FACS管（总体积3ml）中的5,000个珠（在2ml中）中加入2×10 6 HUVEC（1ml的2×10 6个细胞/ml）。将管垂直放置在孵化器中。这对于?20口井就足够了。
5. 在37°C孵育4小时，倒置和混合管每20分钟。珠子在珠粒后应该看起来像迷你高尔夫球（图1）。
6. 4小时后，将包被的珠子转移到T25组织培养瓶中，并在37℃和5％CO 2的总体积为5ml的EGM-2中放置过夜。
将包被的珠子包埋在纤维蛋白凝胶（第0天）中
1. 将0.15单位/ml抑肽酶加到15ml纤维蛋白原溶液中
2. 检查HUVEC涂层珠。转移5毫升涂层的珠子到15毫升锥形管，让珠子沉降。使用额外的5ml培养基冲洗掉粘在烧瓶上的珠子。
3. 让珠子沉淀到管的底部。吸出介质。将珠子重悬在1ml EGM-2中，并转移到1.5ml离心管中
4. 用1ml EGM-2洗涤珠子2次，用P1000移液管非常缓慢/小心地上下吹打混合（珠子是脆弱的）。
5. 向24孔板的每个孔的中心加入6.25μl凝血酶储备溶液（50U/ml）。这将导致0.625U/ml，一旦在下一步中加入0.5ml纤维蛋白原/珠悬浮液。
6. 通过轻轻地向上和向下吸取纤维蛋白原/珠混合物溶液。向每个孔中加入0.5ml纤维蛋白原/珠悬浮液。
7. 混合凝血酶和纤维蛋白原/珠通过轻轻吸取上下轻轻?五次。更换每个孔的移液器吸头，以防止吸头之间的孔凝结。避免在纤维蛋白凝胶中产生气泡（可能阻碍凝胶的可见性）。不要移动板，以避免撕裂纤维蛋白凝胶。
  注意：通常，当形成纤维蛋白凝胶时，凝胶中将存在微小的气泡。它们将在3到4天后消失。
8. 允许纤维蛋白原/珠溶液在室温下在通风橱中固化5分钟。重要的是，在凝块的前5分钟期间板不被干扰，因为剪切的纤维蛋白减少发芽。 5分钟后，在显微镜下检查珠子是否均匀分布（不结块在一起）。理想地，每个孔应该有200-250个珠注意：增加每个孔的珠数会导致更早的吻合。
9. 然后在37℃和5％CO 2孵育10-15分钟
10. 在等待时，胰蛋白酶消化成纤维细胞，并重新悬浮于调节至1×10 6细胞/ml（或1,000细胞/μl）的EGM中。
  注意：成纤维细胞会在纤维蛋白凝胶上增殖，迁移和形成单层。
11. 制备适当量的含有选择的血管生成抑制剂（50μg/ml的阿柏西普，50μg/ml的Dll4 MAB，10μg/ml的整联蛋白α-6抗体GoH3）的EGM-2培养基。
12. 孵育后，向每孔中缓慢加入1ml制备的EGM-2（逐滴）。如果添加的介质太快，可能会撕裂凝胶。
13. 种子20微升的NHLF细胞溶液（20,000个细胞）的凝块顶部到每个孔。直接添加到孔的中心和介质中。
14. 每隔一天（第2天，第5天，第7天，等）更换新鲜的EGM-2培养基，直到达到理想的生长（见下面的注释），并相应地捕获图像。注意：
凝胶加工和DNA和肌动蛋白的新芽染色
1. 为了停止测定，将500μl的2％多聚甲醛（PFA）在37℃下加入凝胶1小时，随后在室温（RT）下温育过夜。用PBS洗涤两次。
2. 为了染色内皮新芽，用500μl0.5％Triton X-100将凝胶透化20分钟，用PBS洗涤两次。
3. 在室温下与500μlPhalloidin-TRITC（1：1,000）和Hoechst 33258（1：2,000）在PBS中的混合物孵育1小时。
4. 用PBS洗涤两次。
注意：为了定性评估内皮萌芽，可以在明视野设置下在期望的时间点用倒置显微镜对EGM-2培养基覆盖的24孔板进行成像（图2）。
在ImageXpress ^{MICRO XL}
上进行图像采集
1. 纤维蛋白珠测定在24孔光学板（Sensoplate）中进行。
2. 使用自动显微镜ImageXpress ^{MICRO XL和MetaXpress（MX）软件，以如下方式用10x物镜获得整个孔的图像：对于每个位点，使用专有Z-堆叠日志收集十六个聚焦平面， 10μm。专有Z堆栈日志是用MX软件编写的配置日志（宏）。组态的日志包括一个"命令"，引导舞台在Z平面中移动，然后是一个命令，引导收集16个图像，间隔10μm，然后命令创建最大。这些16幅图像的强度投影。}
3. 使用MX最大强度投影算法将平面折叠成一个最终图像。
  
  图1.用人脐静脉内皮细胞涂覆Cytodex珠。在涂覆内皮细胞（B）之前（A）和之后的Cytodex珠的明视野图像。 Hoechst 33258染色鉴定包被珠粒上的内皮细胞核（C）。比例尺表示100μm
  
  图2.血管生成抑制剂aflibercept和Dll4 MAB对HUVEC发芽的影响。Aflibercept治疗定量抑制HUVEC发芽，而用Dll4 MAB阻断Dll4增加HUVEC发芽长度和分支点数。比例尺表示100μm。星号标记分支点。
  
  图3.整联蛋白α-6抗体GOH3显着抑制HUVEC萌芽。显示了透射光通道（左图）或TRITC通道（中间和右图）中的染色芽的代表性图像。在ImageXpress ^{MICRO自动显微镜上获得固定凝胶的荧光图像。比例尺表示100μm。 B.通过使用MetXpress软件的"Subtract"函数从总分割区域图像（图3A，中间图）减去对应于珠粒面积的圆形形状，得到芽芽区域图像（右图）。}

数据分析

使用MetaXpress ^TM软件（MX）进行图像分析：为了计算每个珠的内皮细胞的数量，使用配置的MX定制模块结合配置的MX分析在透射光和DAPI通道中获得的最大强度投影图像多波长细胞计分模块（Kuhnert等人，2015; Sweet 等人，2012）。
为了计算芽的总长度或分支点的数量，使用配置的MX定制模块与配置的MX管形成模块组合来分析在透射光和DAPI通道中获取的最大强度投影图像。通过成对比较中的Student's t检验和多重比较的单因素方差分析来确定定量数据的统计显着性（Kuhnert等人，2015; Sweet et al。 al 。，2012）。

食谱

纤维蛋白溶液
在37℃水浴中将2mg/ml纤维蛋白原溶解在DPBS中通过倒置管混合。
不要涡旋。
通过0.22μm过滤器进行灭菌
凝血酶储备液
在无菌水中以50U/ml重构，并通过0.22μm过滤器无菌过滤每份0.5ml，保存于-20℃
抑肽酶储备液
在去离子水中以4U/ml重构冻干的抑肽酶，并通过0.22μm过滤器无菌过滤分别制备0.5ml的等分试样。
储存于-20°C。

致谢

这项工作由Regeneron Pharmaceuticals，Inc.

参考文献

Eichten，A.，Adler，AP，Cooper，B.，Griffith，J.，Wei，Y.，Yancopoulos，GD，Lin，HC和Thurston，G。（2013）。 VEGF-Trap：具有有效抗肿瘤作用的VEGF阻断剂。 Proc Natl Acad Sci USA 99（17）：11393-11398。

Kuhnert，F.，Chen，G.，Coetzee，S.，Thambi，N.，Hickey，C.，Shan，J.，Kovalenko，P.，Noguera-Troise，I.，Smith，E.，Fairhurst，J 。Andreev，J.，Kirshner，JR，Papadopoulos，N。和Thurston，G。（2015）。用于研究血管生成的优化的血纤维蛋白凝胶珠测定法。（3）：186。

Nakatsu，MN和Hughes，CC（2008）。优化的三维体外模型用于血管生成的分析。

方法 443：65-82。

Nehls，V。和Drenckhahn，D。（1995）。一种基于微载体的新颖体外试验，用于三维细胞迁移和血管生成的快速和可靠的定量。 Microvasc Res 50（3）：311 -322。

Noguera-Troise，I.，Daly，C.，Papadopoulos，NJ，Coetzee，S.，Boland，P.，Gale，NW，Lin，HC，Yancopoulos，GD和Thurston，G。 Dll4的阻断通过促进非生产性血管生成抑制肿瘤生长。 444（7122）：1032-1037

Sweet，DT，Chen，Z.，Wiley，DM，Bautch，VL和Tzima，E。（2012）。