材料和试剂

8室玻璃载玻片（8孔培养载玻片）（Corning，Falcon ，目录号：354108）
5ml，10ml和25ml血清移液管，无菌，单独包裹（Thermo Fisher Scientific）
15ml和50ml锥形无菌聚丙烯离心管（Thermo Fisher Scientific）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-5446）
盖玻片（22×60mm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-544G）
6孔培养板
12孔细胞培养板
T75瓶
气溶胶屏障移液管吸头（10μl至1,000μl）（Thermo Fisher Scientific）
未过滤的1ml移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：13-611-101）
0.45μmmillex注射器过滤单元（EMD Millipore，目录号：SLHA02510）
Millex排气0.22μm注射器过滤单元（EMD Millipore，目录号：SLGSV255F）
Kimberly-Clark kimwipes（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：06-666A）
子宫细胞
大鼠尾胶原蛋白-I * Cultrex 3-D培养基质大鼠胶原I：4mg/ml（Trevigen，Cultrex ，目录号：3447-020-01）
I型胶原：4.48mg/ml（EMD Millipore，目录号：08-115）
胶原I，高浓度：8-11mg/ml（Corning，目录号：354249）
注意：来自Trevigen的大鼠尾胶原蛋白-I是实验室中最常用的基质，但是取决于要制备的凝胶的浓度，我们常规使用来自其他供应商的胶原蛋白-I。按照制造商的储存条件，因为不正确的储存会导致胶原蛋白的粘度增加和难以处理。
10x PBS（通过0.2μm过滤器过滤）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：70011044）
氢氧化钠（NaOH，6N）（VWR，目录号：JT5672-2）
双蒸水（DD水;通过0.2μm过滤器过滤）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25300054）
Dulbecco改良的Eagle培养基/F12（DMEM/F12，具有酚红）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11320-033）
胎牛血清（FBS）（定义）（GE Healthcare，Hyclone ^TM，目录号：SH30070.03）
Glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050061）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
Fungizone（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15290018）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
或16％多聚甲醛溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G5417-100G）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443）
正常山羊血清（NGS）（Abcam，目录号：ab156046）（在1x PBS中稀释）
二抗：Alexa 488（按照厂商稀释说明）（Thermo Fisher Scientific，Invritrogen ^{TM，目录号：A11008）}
对平滑肌α肌动蛋白（0.2mg/ml）（Abcam，目录号：ab5694）的第一抗体
使用DAPI（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36931）的Prolong Gold抗防晒剂。
DPBS（无镁或钙）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190144）
牛血清白蛋白（BSA）（35％的DPBS溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：A7979），在1x PBS中稀释
10％生长培养基（见配方）
5％生长培养基（见配方）
1N NaOH（见配方）
3mg/ml胶原凝胶（见配方）
0.15 M甘氨酸/PBS（见配方）
4％多聚甲醛/PBS（参见配方）
PBS中的封锁缓冲液（参见配方）
PBS中的初级ab稀释缓冲液（参见配方）

注意：
a。保持＃1-3在-20°C，如果可能或4°C过夜（我有一个小的-20°C冰柜紧邻我的文化罩）。
b。在开始实验前将＃15-18放在冰面上。

设备

显微镜（Nikon，型号：Eclipse TS100）
离心机（Eppendorf，型号：5804R）
自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，型号：TC20 ^TM）
血细胞计数器（如果自动细胞计数器不可用）
金属50ml支架（例如，蓝色阳极氧化铝[Thomas Scientific，目录号：1225W71]）
注意：-20°C（如果可能）或4°C过夜。
95％空气/5％CO 2培养箱中37℃和95％相对湿度的培养箱中
在4℃振荡器和室温下振荡器
真空吸气器
热板/搅拌器（Fisher Scientific）
Pyrex烧杯（100ml）（Fisher Scientific）
平头钳（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：16-100-111）
显微镜：共焦激光显微镜（，例如，Carl Zeiss，型号：ZEISS LSM 800）

程序

注意：所有步骤在细胞培养罩下进行，即无菌条件。

确定所需的量
确定胶原，中和溶液，10x PBS和生长培养基的体积如下：
1. 计算制备用于8室幻灯片（0.5ml /孔）或6孔培养板（2ml /孔）的最终浓度为1.3-3mg/ml的胶原凝胶所需的胶原体积。注意：我们通常制备额外的凝胶溶液（?1ml额外）以解释胶原的粘度，并确保我们有足够的每个凝胶。
2. 中和溶液（新制备的1N NaOH）的量计算为0.023x体积的胶原。
3. 加入10x PBS作为1x（v/v，总体积）。剩余体积由过滤的DD水构成注意：如果不使用10x PBS，然后用5％生长培养基更换最终体积
细胞的制备
1. 在胰蛋白酶消化前，铺在T75瓶中的子宫细胞（永生化细胞;见 Malik等人，2008）应该是50％-80％汇合。注意：单元格应该是积极分割，而不是接触禁止，如果100％汇合的情况。
2. 完全从烧瓶中删除生长培养基，然后加入3ml胰蛋白酶。确保T75烧瓶的整个表面积被涡旋的胰蛋白酶溶液覆盖。离开3分钟，轻拍烧瓶，并在显微镜下观察，以查看子宫肌细胞是否分离。
3. 一旦观察到细胞已从烧瓶表面脱离，通过以1:1（v/v）比例添加生长培养基（10％）停止胰蛋白酶消化反应。吸取细胞在50ml锥形管中注意：生长培养基10％DMEM/F12是在室温下。
4. 在25℃下以800rpm/75xg离心细胞10分钟。
5. 在最小体积的10％生长培养基中重悬沉淀。 *在这一点上非常重要的是让子宫肌细胞进入单细胞悬浮液注意：重悬体积取决于您具有多少细胞，例如，1×10 6个细胞可以重悬于0.75-1ml生长培养基中。 *如果无法进入单细胞悬浮液，可以添加更多的10％生长培养基，但记下总体积。混合细胞的速度应缓慢而温和，因为高速会导致细胞剪切。
6. 使用自动细胞计数器或血细胞计数器计数细胞。计划使用1-1.5×10 5个细胞/ml的3D胶原凝胶，以在8个空间的载玻片中得到约5×10 4个细胞/孔的最终细胞计数。
  注意：要添加的单元数应根据所使用的单元格的划分速率进行优化。癌细胞比正常细胞更容易分裂。
7. 可将细胞保持在通风橱下（在无菌条件下）长达15分钟。由于细胞趋向于在长期储存时沉降到管的底部，在添加到制备的胶原基质之前，推荐温和混合。
在3D培养中培养肌层细胞
注意：以下步骤至关重要。
1. 在实验开始之前，所有溶液（见材料和??试剂）应在冰上并准备好。锥形管的金属支架，50 ml锥形管和-20°C或4°C的血清移液管。
2. 随着肌层细胞计数，在冰上的所有溶液（包括大鼠尾部胶原）应当在细胞培养罩下移动。
3. 一旦细胞计数并准备好，以下步骤应该在10分钟时间内完成，以避免细胞活力的损失。
1. 有一个50毫升锥形管在冷金属支架准备在细胞培养罩。
2. 为了创建胶原凝胶，加入适当体积的10x PBS，DD水（或5％生长培养基）到冷的50ml管中。接下来，加入中和溶液，最后加入胶原蛋白。使用冷移液器将所有溶液混合在一起。
  注意：当使用冷移液器时，与室温下相比，粘性胶原蛋白倾向于平稳移动。确保保持中和溶液和胶原冷（在冰上），直到你准备使用它们，因为较高的温度增加胶原聚合的速率。如果使用5％培养基，溶液将具有黄色/粉红色色调。
3. 加入细胞（0.5ml，相当于5×10 5个细胞），使用1ml Eppendorf移液管，在冷的50ml管中的胶原溶液中间以旋涡运动。用冷移液管再次快速混合溶液。
  重要提示：从这一步开始，应该没有停止时间。移液步骤应当快速进行，因为细胞在冷的溶液中，它们可能丧失活力。
4. 吸取0.5毫升每孔在8室幻灯片。取无菌的Eppendorf移液器吸头，沿着孔的内壁运行。这倾向于均匀地铺展胶原溶液，使得凝胶由于表面张力而不具有凹入结构。
  注意：空心玻片也保持冷。他们可以放在文化罩内的冰袋上。
5. 将盖放回室幻灯片上，立即将覆盖的幻灯片放在孵化器中，在37℃。带有细胞的胶原凝胶将在约30分钟内聚合
6. 向聚合的3D培养物中轻轻加入0.35ml 5％生长培养基。体积应完全覆盖凝胶。将细胞培养物在37℃下保持在湿润的95％空气/5％CO 2培养箱中。 *每天或根据需要更换新鲜培养基。
  注意：随着子宫肌细胞（平滑肌细胞）生长，胶原基质趋于收缩。添加5％培养基而不是10％培养基会减缓这一过程。
  细胞培养基DMEM/F12含有作为pH指示剂的酚红。当3D肌层细胞培养基中的培养基从红色变为黄色时，表明培养基具有酸性pH。这表明活跃分裂细胞。为了保持接近中性的pH（7.2-7.3），重要的是每天更换8个室幻灯片中的3D培养物的培养基。
7. 显微镜图像：当在显微镜下观察时，肌层细胞的形态被添加到3D胶原凝胶中，包括球形和半透明的外观，表明细胞是健康和活的。由于来自人子宫肌层的细胞是平滑肌细胞，在8-10小时内，我们的细胞获得平滑肌细胞的长长主轴形状特征。在2周内，细胞形成纺锤形细胞网络（参见图1）重要注意事项：如果子宫肌细胞在胶原3D培养的48小时内没有获得纺锤形状，则可以认为细胞不再存活。
  
  图1. 3D肌层培养全凝胶暴露于抗α平滑肌肌动蛋白（细胞间蛋白，绿色）;和DAPI（蓝色）用于核识别。 A.在1-1.5周生长后的3D培养; B.生长4周后的3D肌层培养
3D培养物的细胞免疫荧光
细胞免疫荧光标记方法从Wozniak和Keely（2005）和Malik和Catherino（2012）修改。
1. 在约4周的生长后或当形成细胞网络时收集3D培养物（参见图2的细胞百分比图）。
  注意：细胞网络应该由4周的生长形成。这是假设所有细胞都是可行的。
  
  图2. 3D肌层培养全凝胶暴露于抗α平滑肌肌动蛋白（细胞间蛋白，绿色）;和DAPI（蓝色）进行核识别。 A。 10％汇合; B.30％汇合; C.50％汇合（2周生长）; D.80％汇合（4周生长）。融合计算基于视觉近似。 10x放大
2. 固定：在用1×PBS（不含Mg 2+或Ca 2+ 2+）洗涤两次1分钟后，将凝胶在4℃下在新制备的4％多聚甲醛中固定过夜轻轻摇动。
  注意：大多数洗涤是在室内进行的。确保凝胶完全覆盖。在8室载玻片中，需要350-400μl体积。真空吸气器上的抽吸速率（与培养罩中相同）保持较低。我们通常将带有窄尖的未过滤的1ml移液管吸头连接到吸气管。吸入应仔细进行，因为胶原凝胶，如果不坚固，可以吸入。
3. 使凝胶在室温下稳定（RT，10分钟），然后在室温下轻轻摇动用1x PBS洗涤两次10分钟。
4. 将凝胶在0.15M甘氨酸中孵育10分钟。随后用1×PBS洗涤凝胶10分钟，轻轻摇动注意：此步骤可以淬灭由甲醛引起的任何自发荧光和/或荧光。
5. 透化：将3D凝胶暴露于0.05％Triton X-100在室温下温和摇动20分钟，使细胞透化。透化后，用1×PBS洗涤两次10分钟，轻轻摇动注意：凝胶应完全浸没在溶液中。在8腔玻片中，需要350-400μl体积，或观察到。
6. 封闭：将细胞在室温封闭1小时（或在37℃培养箱中封闭30分钟）。用3D凝胶向室中加入350μl封闭缓冲液（参见Recipes）。如果在37℃下阻塞，则室玻片应保持在潮湿的室中。摇动是可选的。
  注意：对于阻断步骤，使用制备二抗的动物的正常血清。我们使用NGS（正常山羊血清）作为我们的第二抗体在山羊。湿室：我们在培养皿中使用湿纸巾，并将腔室载玻片放置在其上。
7. 如果在37℃下进行封闭，使室滑动冷却至室温（RT下5分钟）。在与一抗孵育之前应该除去封闭缓冲液。
8. 一级抗体：将凝胶暴露于1：100稀释（终浓度为0.02μg/ml）的平滑肌特异性（SMC）α-肌动蛋白抗体。在稀释缓冲液（参见Recipes）中制备一抗，并将凝胶在室温下孵育2小时或在潮湿的室中在4℃下温育过夜。轻轻摇动是可选的。
  注意：主稀释缓冲液非常类似于封闭缓冲液，因此其间没有冲洗。凝胶应完全浸没在含有一抗的缓冲液中。
9. 洗涤：在1x PBS中三次洗涤10分钟，每次轻轻摇动注意：清洗后的所有步骤都是在低光照条件下进行的。
10. 第二抗体：将凝胶在浓度为1μg/ml稀释缓冲液的Alexa 488缀合的第二抗体中在室温下孵育40分钟。轻轻摇动。
  注意：将第二抗体稀释并在低光条件下加入到室中。
11. 将凝胶在1x PBS中洗涤两次，每次10分钟，轻轻摇动
12. 将个体凝胶从室中取出并置于载玻片上。取一个新的幻灯片，并使用平头钳子轻轻地从腔室中取出凝胶。每张幻灯片使用一个凝胶。舍弃腔室玻片，因为它不再无菌注意：由于胶原凝胶由于子宫肌层细胞（平滑肌细胞）的生长和收缩性质而收缩，所以凝胶大小可从5mm的高度减少到<在4周生长结束后2mm（图3A和3B）
  
  图3.由于子宫肌层细胞生长导致的3D基质的收缩。 A.在8室玻片的单室中描述子宫肌细胞3D培养。红色区域表示含有子宫肌细胞的胶原凝胶。生长4周后，凝胶收缩至原始凝胶的三分之一或更少。 B.在12孔细胞培养板中生长的子宫细胞3D培养物显示在1周龄3D培养物中的总体大小与在右侧的90-100％融合的5周龄3D培养物相比的差异。将培养物转移到6孔细胞培养板中，以更好地显示大小差异
13. 额外的解决方案是使用无绒的kimwipes邪恶。
  注意：凝胶不应太湿。如果kimwipe轻轻地接触到凝胶的角落，它倾向于吸收，并删除所有额外的解决方案。凝胶不应该放在金缕梅上，因为它很快干燥，很难将凝胶与揩巾分开。
14. 全凝胶安装：在凝胶上加入一至二滴带有DAPI的Prolong Gold封固剂。使用盖玻片轻轻地按下凝胶。擦去额外的凝胶底座并使载玻片干燥过夜。
15. 使用激光扫描共焦显微镜收集图像。

笔记

如果3D培养物中的子宫细胞要用任何实验药物或化合物治疗，则当3D培养物为30-50％汇合时，应进行治疗（参见图2）。更高的汇合导致凝胶收缩。
具有较高胶原浓度（4-6mg）的凝胶不会如同快速收缩，因为刚度增加。更硬的胶原凝胶不能经历整个凝胶安装。切片可以用锋利的刀片制成，他们可以安装与Prolong黄金和分析。
整个凝胶（3-6mg胶原）可用于冷冻切片（冷冻切片）程序。将凝胶嵌入OCT中，冷冻并切片。这些部分可用于细胞免疫化学或细胞免疫荧光分析
凝胶还可以在甲醛（10％）中固定过夜并摇动并用石蜡包埋（Malik等人，2016; Patel等人，2016），用于免疫组织化学分析

食谱

10％生长培养基
含有10％FBS的Dulbecco改良Eagle培养基/F12（含有酚红的DMEM/F12），1×glutamax，1×抗生素（青霉素 - 链霉素）和1×复方。
5％生长培养基
含有5％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基/F12（含有酚红的DMEM/F12），1×glutamax，1×抗生素（青霉素 - 链霉素）和1×复方。
1N NaOH
1ml 6N NaOH
5ml DD水
注意：中和溶液;新鲜制备并通过0.2μm过滤器过滤。中和溶液将控制最终胶原凝胶的pH。
3mg/ml胶原凝胶
3.0ml 5mg/ml大鼠尾胶原蛋白-IV 加入0.069ml 1N NaOH 0.5ml的10x PBS
生长培养基中的0.5ml细胞
0.931ml DD水
总体积：5ml
注意：0.5ml 10x PBS和0.931ml DD水可以用1.431ml 5％生长培养基替换。
0.15 M甘氨酸/PBS
分子量：75.07
称重563mg，并溶于50ml 1×PBS中制备的溶液可以在4℃下储存
4％多聚甲醛/PBS
注意：所有的工作要在通风橱和手套下进行。我们总是使用新鲜制备的解决方案。

将45ml DD水置于烧杯中，使用热板并在搅拌下加热至60℃。
在搅拌下，缓慢加入2g多聚甲醛粉末。不要将溶液加热到70°C以上，因为多聚甲醛容易解聚
加入1滴1N NaOH。解决方案应该在几分钟内清除。会有一些细小的颗粒不会消失。这些将以后通过过滤除去
从热中取出烧杯，加入5 ml的10x PBS。混合好。最终体积为50 ml。
让它冷却至室温。通过0.45μM膜过滤器过滤并立即使用。
*对于16％多聚甲醛的稀释，使用10ml来自1个玻璃小瓶的溶液，并加入30ml的1×PBS，得到最终的40ml 4％多聚甲醛的PBS溶液。

在PBS中阻止缓冲区
1％正常山羊血清（NGS） 1％牛血清白蛋白（BSA）
在PBS中的ab稀释缓冲液
1％正常山羊血清（NGS）

致谢

这个协议是在Malik和Catherino（2012）发表的一个详细版本，

参考文献

Malik，M.，Webb，J.和Catherino，WH（2008）。视黄酸治疗人类平滑肌瘤细胞将细胞表型转化为强烈类似于子宫肌瘤细胞的表型。临床内分泌学（Oxf）69（3）：462-470。 />

Malik，M.和Catherino，WH（2012）。用于子宫平滑肌瘤和患者匹配的子宫肌层的三维体外模型的开发和验证。 Fertil Steril 97（6）：1287-1293。 br />

Malik，M.，Britten，J.，Segars，J. and Catherino，WH（2014）。 3维培养物中的平滑肌瘤细胞表现出与2维培养物相比对法舒地尔（一种rho-激酶抑制剂）的减弱的反应。 Reprod Sci 21（9）：1126-1138。

Malik，M.，Britten，J.，Cox，J.，Patel，A. and Catherino，WH（2016）。使用三维胶原凝胶研究T47D乳腺上皮细胞中的力学转导。 > Biol Proced Online 7（1）：144-161