材料和试剂

注意：该协议是在2015年1月在西非埃博拉病毒爆发期间使用当时可用的材料和试剂建立和测试的。随着Minion平台的发展迅速，可能需要进行一些修改，以便采用目前可用的材料和试剂的协议。特别地，虽然当时该技术仅提供给MinION接入程序的成员，但现在已经可以商业化。

0.2ml PCR管（理想地为8条）（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：AB0490）。
1.5ml管（例如，Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S348903）
Eppendorf蛋白LoBind管，1.5ml，PCR清洗（Eppendorf，目录号：0030108116）
手套
Minion flowcell，revision 7.3（Oxford Nanopore Technolgies [ONT]）
根据适当的安全规程从患者血液样品新鲜纯化（或储存于-80℃）的RNA
SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080051）
DEPC处理的无核酸酶的水（例如Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9906）
引物，10μM（序列见表1）;引物CGGACACACAAAAAGAAAGAAG，浓度为2μM和10μM
dNTP混合物，各10mM（例如，New England Biolabs，目录号：N0447S）
iProof TM sup/high高保真聚合酶（Bio-Rad Laboratories，目录号：1725301）
Agencourt AMPure XP珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）
His-Tag dynabeads（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：10103D）
用于在1.5ml管（例如，Beckman Coulter，目录号：A29182）中用Agencourt AMPure XP珠粒进行PCR纯化的磁性架子
70％乙醇
Qiagen洗脱缓冲液（QIAGEN，目录号：19086）
50x TAE缓冲液（理想地为10.2ml等分试样）（例如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：B49）*
琼脂糖（理想地，在0.5g的预称重等分试样中）（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16500100）*}
DNA标准（例如，New England Biolabs，目录号：N3200S）*
6x凝胶负载染料（例如，New England Biolabs，目录号：B7022S）*
快速blast DNA染色（Bio-Rad Laboratories，目录号：1660420）*
NEBNext dA-tailing module（New England Biolabs，目录号：E6053S）
NEBNext末端修复模块（New England Biolabs，目录号：E6050S）
Blunt/TA连接酶主混合物（New England Biolabs，目录号：M0367L）
基因组DNA测序试剂盒SQK-MAP004（ONT）：包含DNA CS，2x洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，EP缓冲液，HP适配器，接头混合物和燃料混合物

*注：可选材料和试剂。

设备

MinION定序装置（ONT）
PCR循环仪（例如Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：A24811）。
Vortexer（例如，Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S96461A）。
用于1.5和0.2ml管（例如，VWR，目录号：93000-204）的微型离心机
移液管：10μl，20μl，100μl，1,000μl，8×20μl具有过滤嘴的多通道（例如，Mettler-Toledo，目录号：PR-10，PR-20， 100，PR-1000，L8-20XLS +）
用于0.2ml PCR管和1.5ml管（例如，Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：05-541-85,05-541-2）的架子
PCR冷却器架，0.2ml，4℃（例如，Eppendorf，目录号：3881000031）。
带有盖子和冷包装的聚苯乙烯泡沫塑料盒（底部为冷冻冷包，顶部为4°C冷包装，然后顶部为样品架）作为冷却器盒（或冰块可用时为冰盒）
具有电源的电泳室（例如，Mupid-exU，Takara Clontech）*
微波炉*
琼脂糖凝胶铸造台，或替代实验室胶带*
250-300ml用于制备琼脂糖的玻璃烧瓶*
用于琼脂糖凝胶染色的盒*
在爆发情况下排序时的其他基础设施
注意：这种基础设施是在任何西方实验室给定的，但是在暴发地区在现场条件下建立方法时应考虑。虽然本主题不能在本协议中详尽涵盖，但以下几点应该仔细考虑。
1. 发电机，不间断电源，稳压器（都取决于电源的质量）。
2. 空调（如果可能），或者外部散热器（例如，?30 x 30厘米的金属板），用于MinION顺序装置。
3. 用于制备1x TAE的清水，以及用于DNA染色和脱色的瓶装饮用水（理想情况下为500ml瓶），如果没有其他来源的清水，可用于此目的。
4. 用于安全样品灭活和RNA提取的设备
5. 4℃冰箱，-20℃冰箱，任选-80℃冰箱用于储存RNA
6. 必要时采取个人防护设备。
*注意：可选设备。

软件

通过3G无线路由器运行具有互联网连接（例如。）的MinKNOW软件v 0.48.2.12（ONT）的膝上型计算机;对于当前的IT要求，请检查ONT网站（ https://nanoporetech.com/community/faqs ）。

程序

使用SuperScript III第一链合成系统的逆转录（RT）
1. 将4μl无RNA酶的水，1μl引物（2μM，CGGACACACAAAAAGAAAGAAG），1μldNTP，5μlRNA，通过轻敲，旋转混合，在65℃下温育5分钟混合，加入PCR冷却器中， 1分钟。
2. 准备mastermix（6μl5x FS缓冲液，1.5μlDTT，1.5μlRNAse输出，1.5μlSuperscript III。所有组分均作为RT试剂盒的一部分提供），向样品中加入7μl，通过轻弹，旋转混合，孵育50℃50分钟，85℃5分钟，保持在4℃，加入1μlRNAse H，通过轻敲，旋转混合，在37℃下孵育20分钟，保持在4℃。 />
使用iProof聚合酶进行PCR
1. 使用来自步骤A2的cDNA作为模板，对于14个反应（表2;包括2个未使用的额外反应）设置主混合物，将12×44.2μl分配到PCR冷却器块上的0.2ml PCR管条中，加入2.5μl正向引物（10μM）和2.5μl反向引物（10μM），根据表1，轻敲，离心，循环（表3，第一PCR）。
2. 使用来自步骤B1的PCR产物作为模板设置28个反应（表2;这包括4个未使用的额外反应）的mastermix，将24×44.2μl分配到PCR冷却器块上的PCR管条中，加入0.8μlPCR产物步骤B1作为模板（参见表1，确定来自步骤B1的PCR产物用作模板），根据表1加入2.5μl正向引物（10μM）和2.5μl反向引物（10μM），轻敲，循环（表3，第二PCR）。有关整个过程的概述，请参见图1.
  
  表1.引物序列。每对引物序列（1个正向引物和1个反向引物）对应一个反应。
  
  表2. PCR主混合
  
  表3. PCR循环条件
  
  图1.文库制备前的PCR扩增示意图
Agencourt PCR纯化
1. Vortex AMPure XP珠10秒。
2. 在24个PCR产物中，产生两个PCR产物池（图1;第一池包含PCR产物1.1-6.2，和第二池PCR产物7.1-12.2），每个包含12×40μl，总共480 μl，并移液至1.5ml Eppendorf管中
3. 向池中加入720μl珠子，通过吸移混合10次，孵育5分钟
4. 将管放在磁铁上，等待5分钟。
5. 小心取出上清液，小心不要吸出任何珠子，加入1,200μl70％EtOH（不要直接吸到珠子上），让其静置至少30秒，用P1000移液管完全取出。
6. 用800μl70％EtOH重复洗涤步骤，用P1000移液管取出上清液，旋转3秒，放回磁铁，用P10移液管取出任何剩余的上清液。
7. 干珠约2分钟，打开盖子，从现在开始盖子打开
8. 取管离开磁铁，加入60μlQiagen洗脱缓冲液，将珠粒沉淀重悬在洗脱缓冲液中，在室温下孵育10分钟。
9. 放回磁铁，等待1分钟（直到珠粒沉淀），取出50μl的洗脱液。汇集来自两个纯化的PCR产物库的洗脱液，总共100μl含有所有PCR产物
可选：琼脂糖凝胶的质量控制
1. 通过将10.2 ml 50x TAE加入500 ml水中制备1x TAE
2. 合并50ml 1x TAE和0.5g琼脂糖，在微波炉中煮沸。
3. 倒入琼脂糖凝胶，冷冻固化
4. 加载15μlDNA梯子和5μl混合样品与1μl6x加载染料在琼脂糖凝胶上，在100V运行约20分钟。
5. 结合50ml FastBlast DNA染色和200ml水，在稀释的DNA染色中孵育琼脂糖凝胶3分钟，然后用几次变化的水冲洗和脱色凝胶，连续摇动凝胶10至20分钟。
6. 使用白色笔记本电脑屏幕作为lightbox可视化凝胶。应该可以看到几个离散条带，对应于各种PCR产物长度（?2.1kb的强条带，?2.7kb的中等条带，1.3,3.4和4.0kb的弱条带）。
图书馆准备
1. 将80μl来自步骤C9的合并的纯化的PCR产物与5μlDNA CS组合，加入10μl10×NEBNext末端修复缓冲液和5μlNEBNext末端修复酶混合物，通过移液混合，在室温下孵育30分钟。
2. 用180μlAgencourt珠清洗，如C部分所述，但使用300μlEtOH洗涤，加入30μl洗脱缓冲液，取出25μl洗脱液，放入PCR管中。
3. 加入3微升10x NEBNext dA尾缓冲液和2微升NEBNext dA尾酶混合物，在37℃孵育30分钟。
4. 解冻2x洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，EP缓冲液在RT，解冻HP适配器，适配器混合和燃料混合在冷却器盒。
5. 准备His珠：
6. 30分钟后，在LoBind管中，加入（直接到管底部）8μl无核酸酶水，30μl来自步骤E3的DNA，10μl衔接子混合物，2μlHP Adaptor和50μlBlunt/TA连接酶主混合物，通过移液混合，如果必要，短暂离心，在室温下孵育10分钟
7. 加入100μl洗涤的珠子（直接到管底部），通过吸移小心混合，在室温下孵育5分钟。
8. 放在磁铁上，等待2分钟以形成沉淀，吸出上清液，用250μl1x洗涤缓冲液洗涤2次，每次30秒。
9. 将盖子关闭，短暂离心，放回磁铁，等待1分钟，盖子关闭，吸出任何剩余的洗涤缓冲液。
10. 取出磁铁，在25μl洗脱缓冲液（将洗脱缓冲液直接加入沉淀）中重悬沉淀，等待10分钟，盖上盖子，放回磁铁，等待1分钟，取出15μl洗脱液（≥预测序混合液）。
加载库（图2）
1. 通过涡旋混合318.5μlEP缓冲液和6.5μl燃料混合物，旋转下来
2. 用150μlEB /燃料混合物冲洗流动池两次。
3. 混合6微升库，141微升EP，3微升燃料混合通过颠倒10次，短暂下降，加载，并启动流动池运行。
  
  图2.启动/加载flowcell

数据分析

一旦在Minion设备上完成测序运行，原始数据必须被碱基化，引物序列必须被去除，然后所有序列必须与参考序列比对以构建堆积，然后可以用于共识调用。这样做的确切程序，包括所有使用的生物信息学脚本，公开在（Hoenen等人。，2016），这是公开访问在此链接： http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/22/2/15- 1796_article 。

致谢

作者感谢位于利比里亚蒙罗维亚ELWA3的前NIH/CDC诊断实验室的所有成员。这项工作部分资助的国家卫生研究院，NIAID的校内研究计划。作者参与了Minion接入计划，并免费或以降低的成本接收了ONT使用的一些流通池和试剂。作者受到ONT的邀请，在ONT在伦敦，英国组织的"London Calling"2015年会议上介绍了这部分工作。

参考文献

De Witho，E.，Falzarano，D.，Onyango，C.，Rosenke，K.，Marzi，A.，Ochieng，M.，Juma，B.，Fischer，RJ，Prescott，JB，Safronetz，D.，Omballa V.，Owuor，C.，Hoenen，T.，Groseth，A.，van Doremalen，N.，Zemtsova，G.，Self，J.，Bushmaker，T.，McNally，K.，Rowe， Emery，SL，Feldmann，F.，Williamson，B.，Nyenswah，TG，Grolla，A.，Strong，JE，Kobinger，G.，Stroeher，U.，Rayfield，M.，Bolay，FK，Zoon， Stassijns，J.，Tampellini，L.，de Smet，M.，Nichol，ST，Fields，B.，Sprecher，A.，Feldmann，H.，Massaquoi，M.and Munster，VJ（2016） a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26814608"target ="_ blank">在埃博拉病毒病爆发期间疟疾诊断的优点。 Emerg Infect Dis 22（2）：323-326。
Hoenen，T.，Groseth，A.，Rosenke，K.，Fischer，RJ，Hoenen，A.，Judson，SD，Martellaro，C.，Falzarano，D.，Marzi，A.，Squires，RB，Wollenberg，KR ，de Wit，E.，Prescott，J.，Safronetz，D.，van Doremalen，N.，Bushmaker，T.，Feldmann，F.，McNally，K.，Bolay，FK，Fields，B.，Sealy，T 。，Rayfield，M.，Nichol，ST，Zoon，KC，Massaquoi，M.，Munster，VJ和Feldmann，H。（2016）。纳米孔测序作为可快速部署的埃博拉疫情工具 Emerg Infect Dis 22（2）：331 -334。

Quick，J.，Loman，NJ，Duraffour，S.，Simpson，JT，Severi，E.，Cowley，L.，Bore，JA，Koundouno，R.，Dudas，G.，Mikhail，A.，Ouedraogo，N B.，Boettcher，JP，Cabeza-Cabrerizo，M.，Camino-Sanchez，A.，Carter，LL，Doerrbecker，J。， Enkirch，T.，Garcia-Dorival，I.，Hetzelt，N.，Hinzmann，J.，Holm，T.，Kafetzopoulou，LE，Koropogui，M.，Kosgey，A.，Kuisma，E.，Logue， Marchens，M.，Michel，J.，Ngabo，D.，Nitzsche，K.，Pallasch，E.，Patrono，LV，Portmann，J.，Repits，JG，Rickett， NY，Sachse，A.，Singethan，K.，Vitoriano，I.，Yemanaberhan，RL，Zekeng，EG，Racine，T.，Bello，A.，Sall，AA，Faye，O.，Faye，O.，Magassouba ，N.，Williams，CV，Amburgey，V.，Winona，L.，Davis，E.，Gerlach，J.，Washington，F.，Monteil，V.，Jourdain，M.，Bererd，M.， A.，Somlare，H.，Camara，A.，Gerard，M.，Bado，G.，Baillet，B.，Delaune，D.，Nebie，KY，Diarra，A.，Savane，Y.，Pallawo，RB ，Gutierrez，GJ，Milhano，N.，Roger，I.，Williams，CJ，Yattara，F.，Lewandowski，K.，Taylor，J.，Rachwal，P.，Turner，DJ，Pollakis，G.，Hiscox， JA，Matthews，DA，O'Shea，MK，Johnston，AM，Wilson，D.，Hutley，E.，Smit，E.，Di Caro，A.，Wolfel，R.，Stoecker，K.，Fleischmann，E 。，Gabriel，M.，Weller，SA，Koivogui，L.，Diallo，B.，Keita，S.，Rambaut，A.，Formenty，P.，Gunther，S.and Carroll，MW（2016）用于埃博拉监测的实时，便携式基因组测序。 530（7589）：228-232。