材料和试剂

Kimtech ^?科学精密组织（Carl Roth，目录号：AA63.1）
2ml微量离心管，安全密封（SARSTEDT，目录号：72.695.500）
吸头提示
铝箔
用于吸光度测量的96孔微量滴定板（例如 UV-Star 微孔板，96孔，半面积，μClear Bio-One，目录号：675801]）
用于荧光测量的96孔微量滴定板（例如96孔，半面积，黑色[Greiner Bio-One，目录号：675076]）
拟南芥种子
无菌蒸馏水
植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001.1000）
液氮
红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：A22188）
H <2>工作溶液
HRP酶
辣根过氧化物酶
次氯酸钠（NaOCl）（Carl Roth，目录号：9062.3）
Triton X-100（SERVA Electrophoresis，目录号：37238或Sigma-Aldrich，目录号：X-100）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9397）
注意：此产品已停产。或者，MgSO 可以使用Carl Roth（Carl Roth，目录号：T888）。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662;或Carl Roth，目录号：3904）
硝酸钾（KNO 3）（Carl Roth，目录号：P021.2）
硝酸钙四水合物[Ca（NO 3）2·4H 2 O]（Carl Roth，目录号：P740.2）
氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：6781.1）
硼酸（H 3 BO 3）（Carl Roth，目录号：6943.1）
硫酸锰（MnSO 4）（AppliChem，目录号：A1038;或Carl Roth，目录号：X890.1）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（VWR，目录号：VWRC29253.236）
硫酸铜五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：AC197720050）
七钼酸铵四水合物[（NH 4）6 Mo 12 Mo 24 SO 4·4H 2 > O]（Sigma-Aldrich，目录号：431346;或Carl Roth，目录号：7311）
D（+） - 蔗糖（Carl Roth，目录号：4621.1）
乙二胺四乙酸铁（FeNaEDTA）（Carl Roth，目录号：8043.1）
3-（2-吡啶基）-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪-4'，4" - 二磺酸钠盐（Ferrozine）（Sigma-Aldrich，目录号：82950）
灭菌溶液（参见配方）
Hoagland培养基（参见食谱）
磷酸盐缓冲液（参见配方）

设备

管旋转器（例如。，VWR，目录号：10136-084）
迫击炮和杵（，例如MTC Haldenwanger）
离心机
多通道移液器
分析标度，例如。，ALJ160_4NM（Kern）
带有冷却的台式离心机（例如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Heraeus Fresco 21离心机）
读板器（例如，Tecan Trading，型号：Infinite M200 Pro）
注意：酶标仪应该能够在530-560nm范围内激发， 590nm，或检测约50nm的吸光度。 560 nm。
均化器（例如，例如Precellys 24均化器）（VWR，目录号：432-3750）

软件

Microsoft Excel

程序

图1提供了从样品制备开始并使用试卤灵检测完成的不同方案步骤的图形概述

图1.描述样品H 2 O 2的测定的不同协议步骤的图形概述，其中H <2> 2 标准和阴性对照，它们根据其身份进行了颜色编码。图3中的板设置使用相同的颜色代码。

用于H 2 O 2含量测量的植物提取物制备
1. 在所需的生长条件下将拟南芥植物生长至所需的年龄。
  1. 在我们的情况下，如先前所述（Lingam等人，2011），将拟南芥种子表面灭菌。将种子在灭菌溶液（参见Recipes）中在室温下在管旋转器上温育8分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤5次。第五次洗涤后，将种子在4℃下在黑暗中储存在0.1％植物琼脂中1-2天以进行分层。
    注意：不要将种子在灭菌溶液中孵育超过8分钟，因为这会导致种子生存力降低。
  2. 将种子播种并在直立的Hoagland培养基琼脂平板上发芽（参见Recipes）。幼苗在长日照条件下（16小时光/21℃和8小时黑暗/19℃）生长5,7,8和10天，然后收获（显示具有10天龄幼苗的平板的实例在图2中）。在植物生长的琼脂平板上直接从枝上分离根（以避免根的干燥），并迅速收集成束。然后非常短暂（一秒钟），轻轻地放在Kimtech精密纸上，以除去多余的水分，然后将其冷冻在液氮中。
    
    图2.在直立的Hoagland培养基琼脂平板上生长10天的野生型拟南芥植物（Col-0）的实例。将植物连续生长足够（左侧）或缺乏（右）铁供应。比例尺= 1厘米。
2. 用液体氮气中的研钵和杵研磨冷冻的根
3. 在预冷的2ml微量离心管中收集冷冻的组织粉末，并在分析秤上称重样品
4. 加入200微升冰冷的磷酸盐缓冲液（见配方）30毫克的组织粉末，并重悬在冰上。如果粉末量不同，则相应地调整缓冲体积。例如，对于15mg粉末，加入100μl磷酸盐缓冲液。为了避免由于粘在移液管吸头上造成植物材料损失，我们不会通过上下移液来重悬粉末。相反，我们让冰上的样品与添加的缓冲液在粉末下不超过一分钟被良好地浸泡。然后，我们翻转微量离心管直到悬浮液看起来均匀注意：我们已经能够成功使用的根粉的最小量已经是15mg，其在我们的生长条件对应于约。 25 10日龄的幼苗。
5. 在16,200×g离心3分钟（对应于在设备中建议的离心机中13,000rpm），4℃。将上清液转移到新的预冷却的微量离心管。这是将用于H 2 O 2 O 2分析的样品（对于样品同一性的实例参见图3A）。将样品保持在冰上，并最多立即进行H 2 O 2 O 2测量。我们没有关于所获得的提取物中H 2 O 2 O 2的稳定性的数据。
H 2 测量
1. 制备10mM Amplex Red试剂储备溶液，1×反应缓冲液（0.05M磷酸钠缓冲液，pH 7.4），10U/ml辣根过氧化物酶（HRP）储备溶液和20mM H 2 SO 4，根据Amplex的过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒提供的说明书，测定2 H 2 O 2工作溶液。
  注意：
  1. 红色试剂是空气和光敏感的。 1x反应缓冲液在室温下是稳定的。应将HRP储备溶液等分并保存在 - 0°C。 2 em> 2 工作溶液只有几个小时才能稳定，因此每次都应准备新鲜。
  2. < em>< em>红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒的制造商方案推荐进行H 2 我们能够成功地执行半体积（50μl）的测定。因此，以下方案基于50μl反应体积。
2. 通过稀释各自量的20mM H 2 O 2 O 2工作溶液制备H 2 O 2 O 2标准曲线与1×反应缓冲液混合以获得每种25μl的H 2 O 2 O 2标准物（0至10μM）。每个反应的最终H 2 O 2 O 2浓度将低两倍（例如，0至5μM）。
  注意：
  1. 0μMH ₂ _{em>标准是重要的阴性对照之一，其显示来自Amplex 红色试剂和HRP在1x反应中的混合物的背景荧光在没有H ₂ >（见阴性对照'否H ₂ '）。}
  2. 在我们的情况下，我们使用具有以下最终浓度的标准物 - 0,1， 2 ，3,4和5μMH ₂ （见图3C中的加载方案）/em>
3. 准备其他阴性对照。阴性对照'Amplex ^？红色背景'（参见图3B中的对照A）在1x反应缓冲液中仅含有Amplex Red试剂，并且为了监测背景Amplex Red试剂本身的荧光/吸光度。为每个H 2 O 2 Sub提取物制备另一个阴性对照，在此称为"样品背景"（参见图3B中的对照C），并且将提取物在1x反应缓冲液中一起与HRP酶，但没有Amplex Red试剂。该对照允许监测可能来自可能用作HRP的底物的植物化合物的存在的单个样品背景，模拟试卤灵的生产。
4. 将25μlH 2 O 2 Sub 2标准品，对照和样品（来自步骤A5）吸移到微量滴定板中。
  注意：在我们的情况下，我们不需要在测定前用1x反应缓冲液稀释样品。然而，可能有必要制备样品的系列稀释物，以确定每次测定的最佳样品量。如Amplex 红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒手册中所述，高H _{2 荧光反应产物）转化为非荧光刃天青。}
5. 使用来自步骤B1（参见表1）的溶液，在避光管中（例如，1小时）制备100μMAmplex Red试剂和0.2U/ml辣根过氧化物酶的工作溶液，，用铝箔包裹）。
  
  表1.工作溶液组成。2.5 ml溶液的示例计算，足够大约。 100分析
  
  图3.样品，必要的对照和标准品以及样品板设置示例。A.样品标识示例。在这种情况下，野生型拟南芥植物（WT）在三个生物重复（1-3）中在足够（+ Fe）或缺乏（-Fe）的供应下生长10天。将来自这些植物的含有H 2 O 2 O 2的根提取物用于阴性对照"样品背景"（C1至C6）和样品（S1至S6）。 B.必要的阴性对照，样品和标准的组成概述。 C.在96孔微量滴定板中设置板的实例。每个对照，样品或标准品用两个技术重复移液
  
  图4.平板读数器的示例设置Infinite ^? M200 Pro用于测量试卤灵荧光（A）和吸光度（B）。注意，Z位置（最佳测量高度在井中）基于预期含有高量H 2 O 2 O 2的孔并用作阳性对照的孔来计算。在这种情况下，这是良好的E6，其含有5μMH Sub 2 O 2 2标准的两个技术重复之一，如图3C中的板设置所示。
6. 通过将25μl工作溶液加入含有H 2 O 2 Sub标准物的每个微量滴定板孔，对照和样品（预先在步骤B4）。另见注4
7. 在室温下在黑暗中孵育反应30分钟。
  注意：由于测定是连续的，反应动力学可以在几个时间点进行测量。
8. 通过测量荧光（在530-560nm激发，在590nm发射）或在560nm处的吸光度（参见图4的示例设置），使用读板器检测试卤灵的产生。见注5.

数据分析

我们建议对来自三个生物重复的样品进行H 2 O 2 O 2的测量，其中每个具有两个技术重复。这里，技术重复是指使用相同对照，标准或根提取物的两个独立的酶反应原始数据的实例，H 2 O 2 O 2标准曲线和用于在根H 2 O 2上的荧光测量的数据分析表示来自10日龄幼苗的提取物显示于图5中。

基于荧光测量的计算
1. 计算阴性对照"Amplex ^？ Red background"，即，Mean（对照A）（也参见图3B和3C）的两个技术重复的平均值，对于H sub 2 O 2 sub标准的两个技术重复的平均值，即平均值（std）。
2. 从Mean（Std）值中减去Mean（对照A）值，即。，Mean（Std-A）。
3. 通过从平均值减去阴性对照'No H sub 2 O 2'（在图3B和3C中缩写为Std 0），校正来自工作溶液组分的背景荧光（Std-A）值，包括Std 0本身，使得Std 0的值变为0.
  （对于每个H sub 2 O 2 <
4. 将步骤A3中获得的值相对于每种标准品的最终H 2 O 2 O 2浓度绘图。获取趋势线的方程（参见图5B的示例）。
5. 计算称为平均值（样品）的每个样品的两个技术重复的平均荧光，以及称为平均值（对照C）的每个阴性对照'样品背景'（在图3B和C中缩写为C）。
6. 通过从平均值（样品）值减去平均值（对照C）值，获得平均值（样品C），校正来自植物提取物本身的背景荧光。
7. 通过使用从H 2 O 2 O 2浓度获得的方程式计算每个样品的H 2 O 2 O 2浓度（以μM计）/sub>标准曲线。
8. 如步骤部分，步骤A4中所述，将200μl磷酸盐缓冲液加入到30mg组织粉末中，并且在所有样品中保持组织和缓冲液体积之间的比率。因此，7.67μl含有1mg组织[（200 + 30）/30]。因此，25μl根提取物相当于3.26mg根材料
9. 在步骤A7中获得的值表示以μM（即，pmol /μl）表示的H 2 O 2 sub浓度。由于测量在50μl中进行，将每μL的H 2 O 2 O 2 pmol的数量乘以50，并除以3.26mg（参见步骤A8），以便将测量标准化为每次反应的根材料的量。获得的值表示在pmol H 2 O 2中的H 2 O 2含量，例如 /mg FW（FW鲜重）。
10. 使用在步骤A9中获得的值计算每条线的三个生物重复和生长条件的平均H 2 O 2 O 2含量。计算标准偏差。
11. 对于数据的最终呈现使用来自步骤A10的平均H 2 O 2内容和标准偏差（例如参见图5C）。< br />
  
  图5.原始数据，H 2 O 2 O 2标准曲线的实例和来自根H 2 O 2上的荧光测量的数据分析表示， sub> O 提取10天龄的幼苗。 A.原始数据的一个例子。相应的板设置如图3C所示。（A）中的原始数据生成的H 2 H 2 O 2标准曲线。 C.数据分析表示的示例。
基于吸光度（Abs）测量的计算
1. 基于吸光度的H 2 O 2含量的计算以与荧光测量相同的方式进行。唯一的区别是，在这里使用两个波长 - 560nm用于测量，650nm用作参考波长。因此，对于计算，必须使用Abs（560）和Abs（650）值之间的差。

笔记

基于我们的经验，非常重要的是，Amplex 红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒的组分尽可能新鲜，并且保护它们免受光，空气和反复冻融循环。次优组件质量导致技术和生物复制品之间的更大变化
变异性的另一个来源是根重量测量。这里，非常重要的是收集和冻结在纸上同样干燥的根，然后研磨它们并确定它们的重量（如"程序"部分A1b中所述）。
对于高通量实验，可能有利的是使用组织匀浆器（例如，例如Precellys24匀浆器）。在这种情况下，代替"程序"部分的步骤A2和A3，称重微量离心管中的根，记录精确重量（例如。约30mg），并用组织匀浆器。然后，按照"程序"，步骤A4和A5所述，添加相应量的冰冷磷酸盐缓冲液，重悬和离心。
由于测定是连续的，当吸移工作溶液到样品，标准品和阴性对照（如"程序"B6中所述）时，应注意使第一个和最后一个样品之间的时间差最小化。我们优选的方法是使用添加工作溶液时的多通道移液器。这样，移液和测量时间非常相似（因为我们使用的微量滴定板读数器测量井很好）。
通常使用荧光测量来计算H 2 O 2 O 2含量在重复之间给出较小的变化，导致不同基因型和生长条件之间较低的标准偏差和更清楚的差异。但是，每次测量荧光和吸光度是可取的

食谱

灭菌溶液
6％NaOCl
0.1％Triton X-100
Hoagland培养基
0.75mM MgSO 4 0.5mM KH 2 PO 4 sub/
1.25mM KNO 3
1.5mM Ca（NO 3）2 sub。 50μMKCl
50μMH sub 3 BO Sub 3
10μMMnSO 4
2μMZnSO 4
1.5μMCuSO 4
0.075μM（NH 4）6 Mo 7 Mo 24 SO 4/
1％蔗糖（pH5.8） 1.4％植物琼脂培养基补充有50μMFeNaEDTA（足够的Fe供应）或0Fe，50μMferrozine（缺乏Fe供应）
磷酸盐缓冲液
20mM K 2 HPO 4（pH 6.5）

致谢

该方案改编自我们公开的工作（Le等人，2016）和Amplex的过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒的手册（ https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp22188 .pdf ）。这项工作得到德国杜塞尔多夫海因里希 - 海涅大学的支持。

参考文献

Le，CT，Brumbarova，T.，Ivanov，R.，Stoof，C.，Weber，E.，Mohrbacher，J.，Fink-Straube，C.and Bauer， "AR"> - >与"FER-LIKE铁缺陷诱导转录子"相互作用的"AR-ABOIDIS THALIANA12（ZAT12）"的ZINC指形子"ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26556796"target ="_ blank" FACTOR（FIT）linking iron deficiency and oxidative stress responses。 Plant Physiol 170（1）：540-557。
Lingam S1，Mohrbacher J，Brumbarova T，Potuschak T，Fink-Straube C，Blondet E，Genschik P，Bauer P.（2011）。氧化应激，抗氧化剂和胁迫耐受性。 Trends Plant Sci 7（9）：405-410。
Mittler，R。和Blumwald，E。（2015）。 ROS和ABA在系统获得性驯化中的作用。植物细胞27（1）：64-70。
als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als als .org/content/66/10/2839.short"target ="_ blank">在植物发育和胁迫耐受的控制中活性氧和激素之间的相互作用。 66（10）：2839-2856。